分子生物學(xué)：重組DNA技術(shù)第3-6節(jié)

重組DNA技術(shù)(DNA克隆或分子克隆)

DNARecombinationTechnique

(DNACloningorMolecularClone)

第二章1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn):重組DNA技術(shù)的發(fā)展史O.T.Avery（1944年）證明，遺傳信息的攜帶者是DNA；1953年,

Watson和Crick提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1958年,Meselson和Stahl證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制同年，Crick提出遺傳信息傳遞的“中心法則”1961年，

F.Jacob和J.Monod提出了操縱子模型1966年，Nirenberg等人破譯了氨基酸的64個(gè)遺傳密碼1972年，P.Berg等率先完成DNA體外重組(諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))1973年，S.Cohen等進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了重組DNA的轉(zhuǎn)化1977年美國南舊金山建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年，第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1982年，美國FDA批準(zhǔn)首例基因工程產(chǎn)品--人胰島素1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉1996年7月）。在培育多莉的過程中，科學(xué)家采用體細(xì)胞克隆技術(shù)，主要分四個(gè)步驟進(jìn)行：

①從一只六歲雌性的芬蘭多塞特(FinnDorset)白面綿羊（稱之為A）的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止分裂，此細(xì)胞稱之為供體細(xì)胞。

②從一頭蘇格蘭黑面母綿羊（稱之為B）的卵巢中取出未受精的卵細(xì)胞，并立即將細(xì)胞核除去，留下一個(gè)無核的卵細(xì)胞，此細(xì)胞稱之為受體細(xì)胞。

③利用電脈沖方法，使供體細(xì)胞和受體細(xì)胞融合，最后形成融合細(xì)胞。電脈沖可以產(chǎn)生類似于自然受精過程中的一系列反應(yīng)，使融合細(xì)胞也能像受精卵一樣進(jìn)行細(xì)胞分裂、分化，從而形成胚胎細(xì)胞。

④將胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一只蘇格蘭黑面母綿羊（稱之為C）的子宮內(nèi)，胚胎細(xì)胞進(jìn)一步分化和發(fā)育，最后形成小綿羊多莉。

換言之，多莉有三個(gè)母親：它的“基因母親”是芬蘭多塞特白面母綿羊（A）；科學(xué)家取這頭綿羊的乳腺細(xì)胞，將其細(xì)胞核移植到第二個(gè)“借卵母親”——一個(gè)剔除細(xì)胞核的蘇格蘭黑臉羊（B）的卵子中，使之融合、分裂、發(fā)育成胚胎；然后移植到第三頭羊（C）——“代孕母親”子宮內(nèi)發(fā)育形成多莉。

人體生長激素釋放激素(SS)抑制和調(diào)節(jié)多種激素的作用從動物腦中提取:5mg---50萬只羊腦基因工程9升大腸桿菌培養(yǎng)液相關(guān)概念

DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理

重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系主要內(nèi)容：第一節(jié)、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念

ConceptAssociatedtoRecombinantDNATechnology克隆(clone):是指從一個(gè)共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個(gè)體所組成的群體獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)

（即DNA克?。?/p>

細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌游锘蛑参铮?/p>

是在體外將不同來源的特異基因或DNA片段插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)建重組DNA分子，然后將重組DNA導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖（稱之為“克隆”），篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子(recombinantDNA,chimeraDNA），即DNA克隆，因此DNA重組技術(shù)又稱為DNA克?。―NAcloning）。DNA克隆(二)目的基因進(jìn)行DNA重組的目的主要有兩方面：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）這些使我們感興趣的基因或DNA序列就是目的基因(targetDNA)。目的基因有兩種類型：

cDNA(complementaryDNA):在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的．與mRNA互補(bǔ)的DNA?；蚪MDNA(GenomicDNA):代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。(三)載體一.表達(dá)載體(expressionvector):為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。二.克隆載體(Cloningvector):為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。第二節(jié)重組DNA技術(shù)操作的基本過程基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：

分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程第三節(jié)重要的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基一.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

大部分Ⅱ型限制酶能夠識別由4個(gè)～8個(gè)核苷酸組成的特定序列。Ⅱ型酶識別具有回文結(jié)構(gòu)的核苷酸序列（圖2-2）?！盎匚摹币鉃轫樧x和倒讀都一樣的詞語切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶：有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶名稱識別序列及切割位點(diǎn)名稱識別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’

HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’

MboⅠ

5’…▼GATC...3’

NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內(nèi)切核酸酶二、DNA連接酶(基因工程的“縫紉針”)：

1.T4噬菌體DNA連接酶：兩個(gè)不同片段雙鏈DNA存在互補(bǔ)粘性末端（Km=0.6μmol/L)或平末端(Km=50μmol/L)。DNA連接反應(yīng)都是由T4DNA連接酶介導(dǎo)

2.大腸桿菌DNA連接酶:不能催化平末端DNA分子的連接三、DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段):

大腸桿菌DNA聚合酶I具有三種酶活性。Klenow片段具有二種酶活性（去除5’3’外切酶活性）。2.TaqDNA聚合酶:耐熱（75-80℃），分子量65kD,也具5’3’外切酶活性。反轉(zhuǎn)錄酶(RDDP):多功能酶，無3’5’DNA外切酶活性，具有3’5’RNA外切酶活性。工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第四節(jié)常用載體

定義載體是攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增和表達(dá)的工具。具備的條件:①具有自主復(fù)制能力②有多個(gè)單一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)（MCS）③具有選擇性遺傳標(biāo)記④分子量小⑤拷貝數(shù)高（10個(gè)～200個(gè)/細(xì)胞）⑥具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

常用載體:質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNAEcoRⅠSacⅠKpnⅠSmaⅠBamHⅠXbaⅠSalⅠPstⅠSphⅠHindⅢpUC19(2686bp)AmprLacZ′

Oriori

pUC19質(zhì)粒載體圖質(zhì)粒

(plasmid):是細(xì)菌內(nèi)攜帶的染色體外的小型雙鏈環(huán)狀DNA，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制。特點(diǎn):1.分子量相對較小能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；有較高的拷貝數(shù)。2.具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于在宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。3.具有多個(gè)限制性酶的單一切口，稱為多克隆位點(diǎn)。便于外源基因的插入。常用質(zhì)粒載體（一）

pBR322質(zhì)粒：由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA通過重組技術(shù)構(gòu)建成，長度為4.36kb，特點(diǎn)：（1）含有復(fù)制起始點(diǎn)和復(fù)制調(diào)節(jié)信號；（2）有單個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，可切開插入目的基因；（3）有抗四環(huán)素基因Ter+和抗氨芐青霉素基因Amp+，便于重組體細(xì)胞的篩選。1.抗藥性標(biāo)記選擇（二）

pUC系列載體:由pBR質(zhì)粒與M13噬菌體構(gòu)建而成，長度為2.674kb，特點(diǎn)：①具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。②“藍(lán)白斑”篩選:

pUC載體中的LacZ′基因可編碼β-半乳糖苷酶（β-Gal）N端的α-肽鏈，該α-肽與宿主細(xì)胞(如E.coliJM109）中F′因子上的LacZ′△M15基因（α-肽缺陷型）的產(chǎn)物互補(bǔ)，產(chǎn)生完整的、有活性的β-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入MCS后，LacZ′α-肽基因的讀碼框被破壞，不能合成完整的β-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。稱為“藍(lán)白斑”篩選。EcoRⅠSacⅠKpnⅠSmaⅠBamHⅠXbaⅠSalⅠPstⅠSphⅠHindⅢpUC19(2686bp)AmprLacZ′

Oriori

pUC19質(zhì)粒載體圖3．根據(jù)β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選:標(biāo)志補(bǔ)救lacZAmN2H

片段COOH

片段X-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal(三）其它質(zhì)粒載體1.能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的載體2.穿梭質(zhì)粒載體(四）T-A克隆載體噬菌體載體粘粒載體人工染色體載體病毒載體主要用于真核生物基因文庫構(gòu)建自學(xué)：在培育多莉的過程中，科學(xué)家采用體細(xì)胞克隆技術(shù)，主要分四個(gè)步驟進(jìn)行：

①從一只六歲雌性的芬蘭多塞特(FinnDorset)白面綿羊（稱之為A）的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止分裂，此細(xì)胞稱之為供體細(xì)胞。

②從一頭蘇格蘭黑面母綿羊（稱之為B）的卵巢中取出未受精的卵細(xì)胞，并立即將細(xì)胞核除去，留下一個(gè)無核的卵細(xì)胞，此細(xì)胞稱之為受體細(xì)胞。

③利用電脈沖方法，使供體細(xì)胞和受體細(xì)胞融合，最后形成融合細(xì)胞。電脈沖可以產(chǎn)生類似于自然受精過程中的一系列反應(yīng)，使融合細(xì)胞也能像受精卵一樣進(jìn)行細(xì)胞分裂、分化，從而形成胚胎細(xì)胞。

④將胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一只蘇格蘭黑面母綿羊（稱之為C）的子宮內(nèi)，胚胎細(xì)胞進(jìn)一步分化和發(fā)育，最后形成小綿羊多莉。

換言之，多莉有三個(gè)母親：它的“基因母親”是芬蘭多塞特白面母綿羊（A）；科學(xué)家取這頭綿羊的乳腺細(xì)胞，將其細(xì)胞核移植到第二個(gè)“借卵母親”——一個(gè)剔除細(xì)胞核的蘇格蘭黑臉羊（B）的卵子中，使之融合、分裂、發(fā)育成胚胎；然后移植到第三頭羊（C）——“代孕母親”子宮內(nèi)發(fā)育形成多莉。

第四節(jié)重組DNA技術(shù)操作的基本過程基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：

分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程第五節(jié)目的基因的獲取和體外重組化學(xué)合成法：較短的基因（60-80bp）基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)一.目的基因的獲取:1.化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物,測序引物,定點(diǎn)突變,核酸雜交探針組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2.從基因組DNA文庫獲取目的基因基因組DNA(genomicDNA):指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列構(gòu)建基因組DNA文庫的基本過程

mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制3.從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTTcDNA:指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA(mRNA或病毒RNA)互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA

基因組文庫和cDNA文庫的比較

PCR技術(shù)的基本過程模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀94oC5’94℃55℃72℃4.PCR技術(shù)獲取目的基因:二.外源基因與載體的連接:體外重組DNA體外重組本質(zhì)上是一個(gè)酶促反應(yīng)過程，在DNA連接酶的催化作用下，將外源DNA分子與載體DNA分子連接成一個(gè)重組分子的過程。連接方式:（一）黏性末端連接（二）平末端連接（三）同聚物加尾連接（四）人工接頭連接（五）T-A克隆BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接1.粘性末端連接不同限制酶切位點(diǎn)的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)Bg

lⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連2.平端連接

DNA連接酶同聚物尾巴同聚物加尾法連接重組DNA分子同聚物加尾連接:在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。利用人工合成的接頭連接重組DNA分子4.人工接頭(linker)連接:由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接5.T-A克隆T-A克隆策略是一種直接將PCR產(chǎn)物插入到載體中的方法。一、重組DNA分子的導(dǎo)入選定的受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件：1.易于接納重組DNA分子導(dǎo)入；2.對載體的復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)無嚴(yán)格限制；3.不存在特異性降解外源DNA的酶系統(tǒng)；不對外源DNA進(jìn)行修飾；能表達(dá)重組體分子所提供的某種表型特征。常用的導(dǎo)入方法:

（一）轉(zhuǎn)化（transformation）（二）轉(zhuǎn)染（transfection）（三）感染（infection）第六節(jié)重組DNA分子的導(dǎo)入和篩選與鑒定轉(zhuǎn)化方法：1.氯化鈣法：細(xì)菌處于低溫、低滲CaCl2溶液中，菌細(xì)胞壁通透性增加，菌體膨脹成球形，經(jīng)短暫熱休克后重組DNA易進(jìn)入2.電穿孔法：除特殊儀器外比氯化鈣法更簡單，使用時(shí)注意電場強(qiáng)度、電脈沖長度、DNA濃度等參數(shù)。特殊處理受體細(xì)胞細(xì)胞膜特性改變（一）轉(zhuǎn)化（transformation）CaCl2處理受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細(xì)菌重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌（二）轉(zhuǎn)染

——將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染

DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染

電穿孔:操作簡單且轉(zhuǎn)染效率高，幾乎可轉(zhuǎn)染任何細(xì)胞用于瞬時(shí)表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)。但是它需要專門儀器，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染:脂質(zhì)體（liposomes）是一種人造類脂膜.用脂質(zhì)體包裹DNA，瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，操作簡單，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，且毒性低、包裝容量大，昂貴。

顯微注射:轉(zhuǎn)染效率高，但需要一定的儀器和操作技巧。主要用于穩(wěn)定表達(dá)（三）感染（infection）感染是指以人工改造的噬菌體或病毒為載體構(gòu)建的重組體DNA，經(jīng)體外包裝成具有感染性的噬菌體顆粒和病毒顆粒后，借助噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA注入細(xì)菌或真核細(xì)胞。感染的效率很高，但重組體DNA需經(jīng)過較為復(fù)雜的體外包裝過程。(一）根據(jù)重組載體的遺傳表型進(jìn)行篩選1．根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)記篩選2．根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)記插入失活選擇3．根據(jù)β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選4．根據(jù)插入的外源基因性狀進(jìn)行篩選(二）限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定（三）核酸分子雜交法（四）PCR法（五）免疫化學(xué)檢測法（六）DNA序列檢測：二.重組體的篩選與鑒定1.抗藥性標(biāo)記選擇AmprTetrBamHⅠ位點(diǎn)BamHⅠ酶切BamHⅠ酶切DNA連接酶目的DNA重組質(zhì)粒大腸桿菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板

2.抗藥性標(biāo)記插入失活選擇3．根據(jù)β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選:標(biāo)志補(bǔ)救lacZAmN2H

片段COOH

片段X-galLacZ藍(lán)色化合物X-gal4．根據(jù)插入的外源基因性狀進(jìn)行篩選

如把酵母基因組DNA隨機(jī)切割后插入到質(zhì)粒載體中，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到組氨酸缺陷型大腸桿菌細(xì)胞中，并在無組氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這樣只有含酵母組氨酸基因并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)化菌才能在無組氨酸的培養(yǎng)基中生長。（二）.限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒

重組質(zhì)粒酶切重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增片段原位雜交（三）.核酸分子雜交法:菌落雜交篩選法（四）.PCR法某些載體的MCS兩側(cè)存在保守的序列，如pGEM系列載體的MCS兩側(cè)是T7及SP6啟動子序列，可根據(jù)此序列設(shè)計(jì)引物，對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果已知目的基因的全序列或其兩端的序列與全長，可設(shè)計(jì)合成一對引物，以轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若PCR產(chǎn)物與目的基因的預(yù)期長度相一致，那么即可初步篩選出含重組體的陽性菌落。雞的β肌球蛋白的克隆和檢出（五）.免疫化學(xué)檢測法（六）.DNA序列檢測ACTGAAGGCT標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志，強(qiáng)啟動子，翻譯調(diào)控序列，多接頭克隆位點(diǎn)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)：1．融合型表達(dá)蛋白所謂融合型表達(dá)是指將外源目的基因與另一基因相拼接構(gòu)建成融合基因進(jìn)行表達(dá)。2．非融合型表達(dá)蛋白3．分泌型表達(dá)蛋白利用分泌型表達(dá)載體，需要在信號肽的幫助下進(jìn)行。4．包涵體

1.原核表達(dá)體系第七節(jié)克隆基因的表達(dá)E.coli表達(dá)體系的不足：不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

；很難表達(dá)大量可溶性蛋白

優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA

可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)2.真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞）真核表達(dá)載體大多是穿梭載體,通常包括以下元件：1．啟動子包括SV40、CMV、RSV及LTR等。2．增強(qiáng)子3．剪接信號4．終止信號和PolyA化信號5．遺傳選擇標(biāo)記：胸苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。新霉素抗性選擇系統(tǒng)

新霉素的類似物G418（geneticin）對真核和原核細(xì)胞均有毒性。表達(dá)載體中攜帶的neor基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶能使G418失活，所以當(dāng)真核細(xì)胞中導(dǎo)入了含neor基因的載體后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞就可以在含有G418的培養(yǎng)基中生長而得以篩選。該選擇系統(tǒng)適用于所有真核細(xì)胞。重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大DNARecombinationTechniqueisCloslyRelatedwithMedicineandhasaGoodPerspective

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交一、A型題：1．以質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w菌的過程稱為：

A．轉(zhuǎn)化B．轉(zhuǎn)染C．轉(zhuǎn)導(dǎo)

D．轉(zhuǎn)位E．感染2．最常用的篩選轉(zhuǎn)化細(xì)菌是否含有質(zhì)粒的方法是：

A．營養(yǎng)互補(bǔ)篩選B．抗藥性篩選C．免疫化學(xué)篩選

D．原位雜交篩選E．Southern印跡篩選3.α互補(bǔ)篩選屬于：

A．抗藥性標(biāo)志篩選B．酶聯(lián)免疫篩選C．標(biāo)志補(bǔ)救篩選

D．原位雜交篩選E．免疫化學(xué)篩選4.溶原菌是指：

A