專題三：成體干細胞(前言和間充質(zhì)干細胞)

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每張內(nèi)容不宜過多匯報語言儀態(tài)方式豐富，交流互動討論課總結(jié)成體干細胞——adultstemcell

在個體的發(fā)育過程：成體干細胞的概念

存在于成年個體的許多組織和器官，比如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力，已經(jīng)分化組織中的未分化細胞，能夠自我更新并在特定條件下，成體干細胞或者產(chǎn)生新的干細胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。成體干細胞的特性（1）極少量，特定區(qū)域（2）通常處于靜息狀態(tài)，分裂緩慢（3）自我更新與分化需要特定的微環(huán)境優(yōu)點分析

獲取相對容易自體成體干細胞避免了移植排斥理論上，成體干細胞致瘤風(fēng)險很低倫理學(xué)爭議較少檢測方法

科學(xué)家尚未就成體干細胞的鑒定標準達成一致。經(jīng)常被采用的鑒定方法包括：

1)體內(nèi)示蹤法2)體外誘導(dǎo)分化移植的方法通過靜脈注射移植。通過椎管注射移植。通過介入方法直接移植到病變部位動脈血管。常見成體干細胞間充質(zhì)干細胞造血干細胞神經(jīng)干細胞角膜緣干細胞胰腺干細胞皮膚干細胞腸上皮干細胞肝臟干細胞間充質(zhì)干細胞

——mesenchymalstemcell

來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)。具有多向分化潛能，理想的種子細胞。間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性形態(tài)特征細胞表面標志

光學(xué)顯微鏡掃描電鏡圖1-8核質(zhì)比高，細胞器少的細胞×25000圖1-9核質(zhì)比較低，細胞器豐富的細胞×25000透射電鏡公認的骨髓MSCs表面標記：A:不表達分化相關(guān)的細胞標志如脂多糖受體CD34以及白細胞表面抗原CD45等。B:但表達CD44、CD54、CD133、CD105、CD90等。間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)采集部位：髂骨上嵴、脛骨和股骨、胸骨和腰椎。分離方法：細胞帖壁篩選法

密度梯度離心法

細胞分子標記分選法

細胞篩篩選法圖1第三代hBMMSCsHE染色×1000圖2hBMMSCsP1,P3,P5代生長曲線圖3hBMSCs成骨誘導(dǎo)第10天倒置相差顯微鏡×400圖7hBMSCs誘導(dǎo)后堿性磷酸酶染色×400圖4第3代hBMSCsCD29表達陽性×200圖5第3代hBMSCsCD90表達陽性×200圖6第3代hBMSCsCD166表達陽性×200間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)分化—成骨細胞

在MSCs培養(yǎng)體系中加入地塞米松、β-磷酸甘油和抗壞血酸等單獨或聯(lián)合誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的MSCs逐漸形成聚集體或結(jié)節(jié),堿性磷酸酶活性也隨之增高,基質(zhì)鈣化明顯,可分化為成骨細胞。

透明質(zhì)酸、骨形態(tài)形成蛋白-2(BMP-2)以及銅等均可促使MSCs向成骨細胞分化。

誘導(dǎo)分化—軟骨細胞（1）三維培養(yǎng)方式（2）無血清培養(yǎng)基（3）添加轉(zhuǎn)讓生長因子β家族成員在成人骨髓的MSCs培養(yǎng)體系中加入地塞米松和TGF-β3,在第14天時,在細胞外基質(zhì)中檢測到Ⅱ型膠原；在含10-7moL/L地塞米松的培養(yǎng)基中培養(yǎng),有Ⅱ、Ⅹ型膠原表達。

誘導(dǎo)分化—脂肪細胞

用異丁基-甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松、胰島素和吲哚美辛（IM）聯(lián)合誘導(dǎo)人的MSCs,可觀察到細胞內(nèi)逐漸聚集含脂質(zhì)豐富的小泡,多種誘導(dǎo)處理可使95%以上的細胞定向分化為脂肪細胞,并且細胞內(nèi)的脂質(zhì)小泡不斷地長大、融合,最終充滿細胞。這些分化的脂肪細胞在體外培養(yǎng)可健康生長至少3個月。誘導(dǎo)分化—心肌細胞

1體外分化實驗小鼠股骨中獲得骨髓MSCs,經(jīng)5氮胞苷處理,大約30%的MSCs出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變,分化為類心肌細胞,并可重復(fù)檢測到自主起搏細胞。

（視頻）(1)分化的MSCs表達出特異性的心房利鈉肽(ANP)和腦利鈉肽(BNP)基因。表明分化的細胞含有類心肌收縮蛋白,完全不同于平滑肌細胞及骨骼肌細胞；(2)電鏡檢查類心肌細胞的超微結(jié)構(gòu)時可觀察到:特征性的經(jīng)閏盤連接的肌節(jié)、中心核和心房顆粒；(3)5氮胞苷處理2～5周后，分化的MSCs電生理檢測到至少有2種完全不同的動作電位：2體內(nèi)分化由MSCs向類心肌細胞分化過程中,除5氮胞苷外,體內(nèi)心臟微環(huán)境對MSCs的分化也至關(guān)重要。Wang等在其實驗中提及心肌微環(huán)境可以支持MSCs移植后的生長和向心肌細胞分化。

“環(huán)境依賴性分化”（milieu-dependentdifferentiation）內(nèi)容：認為生長因子、細胞因子、細胞外基質(zhì)等以及它們在干細胞/宿主細胞之間的相互作用，在誘導(dǎo)MSCs向心肌分化方面起著重要作用。盡管MSCs向心肌分化的具體機制不清楚，但一致傾向認為:組織損傷和高水平的多能細胞是其分化的兩個重要的決定因素。誘導(dǎo)分化—神經(jīng)細胞在丁化羥基苯甲醚(BHA)或β-巰基乙醇作用下,可誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)細胞向神經(jīng)細胞分化用雙丁酰環(huán)磷腺苷(dbcAMP)和異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)處理MSCs可誘導(dǎo)神經(jīng)分化早期標記的表達在神經(jīng)生長培養(yǎng)基中添加EGF和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）同樣可誘導(dǎo)神經(jīng)分化早期標記的表達。在bFGF和PDGF存在下，DMSO/BHA可誘導(dǎo)大鼠骨髓基質(zhì)細胞向神經(jīng)細胞分化。誘導(dǎo)分化—內(nèi)皮細胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多能成體祖細胞(multipotentadultprogenitorcells,MAPCs)是骨髓MSCs的一個亞群。2002年,首次在體外用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)把人骨髓MSCs誘導(dǎo)分化成具有脈管母細胞表型的細胞,隨后這些細胞分化成表達內(nèi)皮細胞標記物的細胞。在培養(yǎng)過程中MAPCs可以不斷擴增80多個群體,倍增時間沒有明顯衰退表現(xiàn),所以在臨床治療方面,MAPCs是一種理想的內(nèi)皮細胞來源。牛垂體內(nèi)皮細胞生長添加劑(endothelialcellgrowthsupplementfrombovinepituitary,ECGS)國內(nèi)學(xué)者用牛垂體內(nèi)皮細胞生長添加劑(endothelialcellgrowthsupplementfrombovinepituitary,ECGS)對兔MSCs進行定向誘導(dǎo)分化，細胞80%融合時呈現(xiàn)“鋪路石