當歸補血湯對荷瘤小鼠化療后免疫功能的影響

當歸補血湯對荷瘤小鼠化療后免疫功能的影響【摘要】目的觀察當歸補血湯對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠免疫功能的影響。方法建立S180荷瘤小鼠模型后，隨機分為4組，荷瘤對照組、CTX組、當歸補血湯＋CTX組及當歸補血湯組。造模次日開始給藥，共10d，停藥次日處死，測定脾臟和胸腺指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬功能、NK細胞活性、T淋巴細胞增殖能力。結(jié)果當歸補血湯可提高化療荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬功能和NK細胞活性，同時還對刀豆素A誘導的T淋巴細胞增殖有促進作用。結(jié)論當歸補血湯具有提高機體免疫功能，抵御化療所引起的免疫功能下降的作用。

【關(guān)鍵詞】當歸補血湯；腫瘤；免疫功能；化療

當歸補血湯方出自李東垣《內(nèi)外傷辯惑論·暑傷胃氣論》，為氣血雙補之經(jīng)典名方。研究表明，此方具有增強免疫的效果［1］。但有關(guān)當歸補血湯對化療荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響報道較少，我們通過建立S180荷瘤小鼠模型，觀察了當歸補血湯對環(huán)磷酰胺化療荷瘤小鼠免疫功能的影響，旨在為該方的提供一定實驗依據(jù)。

1材料與儀器

動物及細胞株

清潔級昆明小鼠，7～9周齡，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證：SCXK(冀)2003-1-003。動物在實驗前適應性馴養(yǎng)1周。飼料和墊料由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗期間自由采食飲水。腹水型S180瘤株由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，L929細胞株由北京市中醫(yī)研究所提供。

藥品

當歸補血湯由黃芪和當歸組成，將上述藥物加水浸泡20min后，煎煮3次，約30min/次，3煎溶液混合過濾，取汁300ml，離心取上清，80℃水浴濃縮至每毫升含生藥，分裝，高溫消毒后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆??；熕幬铮鹤⑸溆铆h(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號：06112021)。

試劑及儀器

DMSO(Amresco公司產(chǎn)品)，四氮甲唑藍(MTT，Amresco公司產(chǎn)品)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司產(chǎn)品)，RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Amresco公司產(chǎn)品)。酶標分析儀，CO2培養(yǎng)箱，超凈臺(蘇凈集團，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，倒置顯微鏡。

2方法

動物模型的建立［2］

無菌條件下抽取6～7d生長良好的S180小鼠的腹水，按1∶3比例用生理鹽水稀釋，反復沖打，充分混勻，在顯微鏡下計數(shù)，用生理鹽水調(diào)整細胞濃度為×107/ml，取于每只小鼠右側(cè)腋窩下碘酊消毒后皮下接種。瘤株接種前，均用%臺盼藍染色，計算活細胞數(shù)為95%～98%。從抽取腹水時開始，到移植完最后1只小鼠的總時間控制在1h內(nèi)。

分組及給藥

小鼠接種24h后按體質(zhì)量和性別隨機分成荷瘤對照組、CTX組、當歸補血湯+CTX組和當歸補血湯組。荷瘤對照組均用生理鹽水灌胃，同時腹腔注射生理鹽水，單純化療組腹腔注射CTXg·kg-1·d-1，同時用生理鹽水灌胃，當歸補血湯+CTX組腹腔注射CTXg·kg-1·d-1，同時用當歸補血湯12g·kg-1·d-1灌胃，當歸補血湯組用當歸補血湯12g·kg-1·d-1灌胃，同時腹腔注射生理鹽水，各組灌胃容積均為ml/只，腹腔注射容積均為ml/只，各組于瘤細胞接種第2日開始用藥，1次/d，連續(xù)10d。

脾臟、胸腺指數(shù)

小鼠脫臼處死，以無菌操作取下脾臟、胸腺，電子天平稱質(zhì)量并計算臟器指數(shù)。

腹腔巨噬細胞吞噬功能的測定［3］

小鼠脫臼處死，75%酒精中浸泡2min，置超凈臺。每只小鼠腹腔注射冷PBS液10ml，輕揉腹部2min，回抽腹腔液，離心棄上清。RPM1－1640培養(yǎng)液洗兩次，計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞濃度為2×106個/ml，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，每樣本均設(shè)3個復孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，溫PBS液洗并吸出未貼壁細胞，得到巨噬細胞單層。于每孔中加入%的中性紅溶液100μl，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，用溫PBS液反復沖洗未被吞噬的中性紅3次。于每孔中加入細胞裂解液（1∶1的冰醋酸和無水乙醇)100μl，4℃靜置過夜，用酶標儀在570nm處測定OD值。

NK細胞活性測定［4］

無菌摘取脾臟，按常規(guī)制備脾細胞懸液，用含10%小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液配成1×107/ml濃度作為效應細胞。取傳代培養(yǎng)的L929細胞，用%胰酶消化液消化2min，加入完全RPMI－1640培養(yǎng)液，調(diào)細胞濃度為2×105/ml作為靶細胞，在96孔平底板上每孔加入靶細胞懸液100μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)90min，使其貼壁成單層細胞，然后實驗孔加入100μl效應細胞懸液，做4個復孔，靶細胞對照孔加完全RPMI－1640培養(yǎng)液100μl；然后將96孔板放在37℃，5%CO2孵箱中孵育20h，去上清，用生理鹽水輕輕注滿各孔，反復3次，以除去效應細胞和被殺傷脫落的靶細胞，在濾紙上吸干孔內(nèi)水分；每孔加入%的中性紅染液100μl，孵育30min，棄去染液，用生理鹽水洗3遍，每孔加100μl細胞裂解液，使含有中性紅的靶細胞溶解，搖勻，用酶標儀在450nm測OD值，用以下公式計算殺傷率。

殺傷率(%)=(靶細胞OD值-實驗組OD值)/靶細胞OD值×100%

T淋巴細胞增殖能力的測定［5］

無菌摘取脾臟，常規(guī)制作脾細胞懸液，用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)細胞濃度至5×106／L，加入96孔細胞培養(yǎng)板100μl/孔，再分別加入ConA100μl/孔使其終濃度為6μg/ml，將上述加好的培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱68h，取出，每孔吸出10μl，加g/LMTT10μl/孔，置培養(yǎng)箱內(nèi)4h，取出，加10%SDS-HCl溶液100μl/孔，振蕩過夜，酶標儀測570nm波長的吸光度(OD)值。以各樣本A值代表其T淋巴細胞增殖能力。

學處理

各組數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS進行方差分析。

3結(jié)果

當歸補血湯對化療小鼠免疫器官重量的影響

荷瘤小鼠在注射CTX后脾臟和胸腺指數(shù)均下降，與荷瘤對照組相比差異顯著，而在聯(lián)合當歸補血湯治療后，二者均增高，差異顯著。結(jié)果見表1。表1當歸補血湯對化療荷瘤小鼠免疫器官重量的影響

當歸補血湯對化療荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響

由表2可知，CTX組與各組相比，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能降低()；CTX聯(lián)合當歸補血湯治療后，小鼠巨噬細胞吞噬功能升高，差異顯著()。表2當歸補血湯對化療荷瘤小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

當歸補血湯對化療荷瘤小鼠NK細胞殺傷率和脾淋巴細胞增殖的影響

荷瘤小鼠用CTX化療后，NK細胞殺傷率和T淋巴細胞增殖顯著降低，統(tǒng)計學差異顯著；而聯(lián)合當歸補血湯治療后二者明顯升高，差異顯著()。見表2。

4討論

目前除手術(shù)外，化學療法是治療腫瘤的重要手段，然而化療在殺滅腫瘤細胞的同時也抑制了機體的免疫功能［6］，脾臟和胸腺是機體重要的免疫器官。胸腺為初級(中樞)淋巴器官，游走的造血干細胞進入胸腺，在此分化增殖成T淋巴細胞，與細胞免疫有關(guān)。脾臟為次級淋巴器官，免疫活性細胞移行于此，并在此進一步增殖、分化和成熟，脾臟中有T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞，與體液免疫、細胞免疫均有密切關(guān)系。二者對細胞毒劑高度敏感，在化療藥物作用下明顯萎縮，其結(jié)構(gòu)較快地發(fā)生嚴重損傷，從而抑制了機體的免疫和抗病能力。胸腺、脾臟指數(shù)在一定程度地反映了機體免疫功能的強弱，因而可用作藥物對免疫功能影響的初步觀察指標。本實驗發(fā)現(xiàn)，CTX化療小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)明顯低于荷瘤組，而荷瘤小鼠用CTX聯(lián)合當歸補血湯治療后，兩臟器指數(shù)明顯升高，說明當歸補血湯可對抗CTX引起的免疫器官受損，保護機體免疫功能。

T淋巴細胞是體內(nèi)重要的免疫活性細胞，主要發(fā)揮細胞免疫功能，在抗腫瘤、免疫監(jiān)視等方面發(fā)揮重要作用。T淋巴細胞在特異性抗原或非特異性抗原，如ConA等的誘導下，會發(fā)生轉(zhuǎn)化增殖。因此，常將T淋巴細胞的增殖反應作為評價T細胞功能，反映機體免疫狀況的常用指標［7］。NK細胞是抗腫瘤的重要效應細胞，它不僅可以直接殺傷腫瘤細胞，也可以通過產(chǎn)生IL-2、干擾素等增強其他細胞的抗腫瘤作用［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠用CTX治療后，T淋巴細胞增殖能力、NK細胞殺傷率和腹腔巨噬細胞吞噬功能均顯著降低，說明CTX可抑制荷瘤小鼠的免疫功能，而用當歸補血湯聯(lián)合CTX治療后，荷瘤小鼠以上免疫學指標的數(shù)值均有所增加，與CTX組比較差異顯著，提示當歸補血湯可增強化療荷瘤小鼠的免疫功能，恢復化療所引起的免疫功能低下，這為該方在的應用提供了一定實驗依據(jù)。

【參考文獻】

1］苗明三，方曉艷.當歸補血湯粗多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2003，19(6)：8.

［2］劉智勤，朱惠學，陳鵲汀，等.六君子湯對環(huán)磷酰胺的增效減毒作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19：2150.

［3］賀宇彤，劉殿武，丁里玉.抗纖Ⅰ號和硒對肝纖維化大鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)雜志，2004，10(3):40.

［4］付于，夏天．消瘤湯治療腫瘤及調(diào)節(jié)免疫功能的實驗研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2004，2：1114.

［5］陳奇.中藥藥理研究方，第2版［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：748.

［6］SakamotoJ，TeramukaiS，NakazatoH，etofadjuvantimmunochemotherapywithOK-432forpatientswithcurativelyresectedgastriccancer:ameta-analysisofcentrallyrandomizedcontrolledclinicaltrials［J］.JImmunother，2002，25(5)：405.

［7］ZhouG，ShengW，YaoW，etoflowmolecularlambda-carrageenanfromChondrusocellatus