量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)技術(shù)方興未艾

量子點(diǎn)免疫層析檢測(cè)技術(shù)方興未艾免疫層析技術(shù)是一種快速、簡便、靈敏、直觀、價(jià)格低廉、可真正實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測(cè)的檢測(cè)方法。具有很多氣相色譜、高效液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用色譜、液質(zhì)聯(lián)用色譜、毛細(xì)管電泳等儀器檢測(cè)方法以及其他傳統(tǒng)方法無法企及的優(yōu)點(diǎn).在檢測(cè)領(lǐng)域中處于特殊重要的地位，同時(shí)也是傳統(tǒng)檢測(cè)和儀器檢測(cè)的良好補(bǔ)充。尤其在經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，生活水平提高的今天,人類重大疾病，環(huán)境污染，食品安全等問題日益受到極大的關(guān)注，讓免疫層析檢測(cè)技術(shù)更具有巨大的潛力和蓬勃的生命力。目前，免疫層析產(chǎn)品主要為膠體金免疫層析試紙條，其最早應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，在早孕檢測(cè)中的應(yīng)用取得了極大的成功，隨后在各個(gè)領(lǐng)域迅速滲透漫延，其在毒品檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)、以及食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到了迅速的發(fā)展，但是又出現(xiàn)新的問題，在很多方面，尤其是食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，有些農(nóng)獸藥殘留限度極度苛刻,甚至要求0。1ng/ml的檢測(cè)限度，同時(shí)食品類物質(zhì)如肉類、禽類、果蔬、谷物等成分復(fù)雜，前處理難度也很大，造成膠體金免疫層析檢測(cè)靈敏度無法勝任。除了進(jìn)一步提高前處理方法以外,尋求高靈敏度的免疫層析方法也顯得尤為重要。量子點(diǎn)是近20年來發(fā)展起來的半導(dǎo)體納米晶材料，因?yàn)樗膬?yōu)良特性，受到了很大的關(guān)注，并且已經(jīng)顯示出一定的潛力,近幾年來從細(xì)胞標(biāo)記等應(yīng)用已逐漸開始向多個(gè)領(lǐng)域的檢測(cè)與診斷方向滲透.一、量子點(diǎn)特性量子點(diǎn)（簡稱QDs,又稱半導(dǎo)體納米粒子）是由II?切族或III?V族元素組成的，半徑小于或接近于激光玻爾半徑,能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的一類半導(dǎo)體納米顆粒，其中研究較多的主要是CdX（x=S、Se、Te）,直徑約為2nm—6nm。量子點(diǎn)由于存在顯著的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng),從而使它具有常規(guī)材料所不具備的光吸收特性，使其應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛,特別是其在免疫生物學(xué)和臨床檢驗(yàn)學(xué)等研究中的潛在的應(yīng)用價(jià)值，已引起了廣大科學(xué)工作者的極大關(guān)注,發(fā)光量子點(diǎn)作為熒光試劑探針標(biāo)記生物大分子，正是近年來迅速發(fā)展的納米材料在生物分析領(lǐng)域的重要應(yīng)用之一。與普通的熒光染料相比較，量子點(diǎn)具有以下特點(diǎn):（1） 有機(jī)染料熒光分子激光譜帶較窄,每一種熒光分子必須用合適能量的光來激發(fā)，而且產(chǎn)生的熒光峰較寬，不對(duì)稱，有些拖尾。這給區(qū)分不同的探針分子帶來困難,很難利用有機(jī)染料分子同時(shí)檢測(cè)多種組分。量子點(diǎn)由于量子限域效應(yīng)使其激發(fā)波長的范圍很寬，可以被波長短于發(fā)射光的光（一般短10nm以上）激發(fā)，并產(chǎn)生窄（半波寬約13nm）而對(duì)稱的發(fā)射光譜，從而避免了相鄰探測(cè)通道的串?dāng)_。（2） 量子點(diǎn)具有“調(diào)色”功能，不同粒徑大小的量子點(diǎn)具有不同的顏色，激發(fā)量子點(diǎn)的激發(fā)波長范圍很寬，且連續(xù)分布,所以可以用同一波長的光激發(fā)不同大小的量子點(diǎn)而獲得多種顏色標(biāo)記，是一類理想的熒光探針。（3） 量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度強(qiáng)，穩(wěn)定性好,抗漂白能力強(qiáng),Chan和Nie通過實(shí)驗(yàn)證明ZnS包覆的CdSe比羅丹明6G分子要亮20倍和穩(wěn)定100-200倍,可以經(jīng)受多次激發(fā)，且標(biāo)記后對(duì)生物大分子的生理活性影響很小,因此為研究生物大分子之間的長期作用提供了可能.(4)生物相容性好，尤其是經(jīng)過各種化學(xué)修飾之后,可以進(jìn)行特異性連接，細(xì)胞毒性低，對(duì)生物體危害小，可進(jìn)行生物活體標(biāo)記和檢測(cè),而傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料一般毒性較大，生物相容性差.(5)熒光壽命長，典型的有機(jī)熒光染料的熒光壽命僅為幾納秒(ns)，這與很多樣本的自發(fā)熒光衰減的時(shí)間相當(dāng)。而量子點(diǎn)的熒光壽命可持續(xù)長達(dá)數(shù)十納秒(20ns-50ns)，這使得當(dāng)光激發(fā)數(shù)納秒以后，大多數(shù)的自發(fā)熒光背景已經(jīng)衰減,而量子點(diǎn)熒光仍然存在，此時(shí)即可獲得無背景干擾的熒光信號(hào)。圖1.量子點(diǎn)二、量子點(diǎn)的合成方法目前合成量子點(diǎn)的方法主要有兩種，一種是在有機(jī)體系中合成，即用金屬有機(jī)化合物在具有較強(qiáng)配位能力的有機(jī)溶劑中制備;另一種是在水溶液中直接合成.有機(jī)相合成法量子點(diǎn)最早采用膠體化學(xué)方法在有機(jī)體系中制備的方法，將金屬和有機(jī)化合物混合在有配位性質(zhì)的有機(jī)溶劑中，在一定的溫度條件下就能生長出納米晶體。這類方法制備的量子點(diǎn)分散性、穩(wěn)定性都較好，不容易聚沉，表面修飾容易?早期合成的量子點(diǎn)往往存在量子點(diǎn)粒徑分布較廣、熒光產(chǎn)率偏低等缺點(diǎn)。1993年,Bawendi及其同事用二甲基鎘和硒的三辛基膦(TOP)配合物作為前驅(qū)體，將其依次注入劇烈攪拌的三辛基氧化膦(TOPO)溶液中，合成了高熒光產(chǎn)率的CdSe量子點(diǎn)，這種方法合成的量子點(diǎn)結(jié)晶性好、尺寸單分散、量子產(chǎn)率約為10%。這種方法較以前來說是一種突破，但當(dāng)量子點(diǎn)制成水溶性時(shí)，其熒光產(chǎn)率會(huì)大大下圖2。1996年,Hines

成功合成了ZnS包覆的CdSe量子點(diǎn)降。后來人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把ZnS或CdS包覆在CdSe納米晶體表面后，熒光產(chǎn)率會(huì)大大提高。1996年，Hines等就用二甲基鋅和六甲基二硅硫烷作為量子點(diǎn)殼層前驅(qū)體制備了CdSe/ZnS核殼式量子點(diǎn)，其量子熒光產(chǎn)率在室溫可達(dá)50%。但上述合成方法均采用（CH3）2Cd作為原料，而（CH3）2Cd的毒性很大，具有易燃、昂貴、室溫下不穩(wěn)定等特性；且當(dāng)（CH3）2Cd注入熱的TOPO后，可能產(chǎn)生金屬沉淀，這些缺點(diǎn)限制了上述方法的推廣使用。2001年P(guān)eng等對(duì)以前的方法進(jìn)行了改進(jìn)，用毒性低安全友好的CdO代替原來有機(jī)相法中的劇毒原料二甲基鎘,在溫和的條件下制備了CdS包覆的CdSe量子點(diǎn)，并且其熒光量子產(chǎn)率可以達(dá)到50%以上。雖然有機(jī)相法合成的量子點(diǎn)有尺寸單分散，熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，但是因?yàn)橛托粤孔狱c(diǎn)與生物環(huán)境不相容,并且制備方法不環(huán)保.如果要用在生物分析領(lǐng)域需要將油相量子點(diǎn)轉(zhuǎn)相為水溶性量子點(diǎn)。油相量子點(diǎn)經(jīng)過水溶性基團(tuán)飾轉(zhuǎn)移到水相中后，其量子產(chǎn)率會(huì)降低，因而在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用甚少.水相合成法AFig.1.QD-nnicelleformationandcharacterization.(A)Schematicofsingle-QDencapsulalioninaphospholipidblcck-copolymermicelle.(E)TEMimageofQD-micellesdriedonacarbon-Formvar-coated200-meshnickelgrid.OnlytheQDsinsidethemiceLLecorearevisible.Theparticlesappearevenlyspreadonthesurface.AlthoughsomeclustersoftwotofourQDsarevisible,mostoftheQDsareisolated,suggestingthatamajorityofmicellescontainasingleQD.(C)TEMimagecfthephospholipidlayerobtainedbynegativestainingwith1%PTA(phosphotungstica<id|atpH7.Withthistechnique,boththeQDandthemicellecanbevisualizedatthewmetime.TheQD(darkspot)appearssurroundedby□wlhitediskofjn-^tainedphospholipidsthatstandsoutagainstthestainedbackground.AJECL100CX7EMvva?operatedat80kV.目前,多利用水溶性巰基試劑作為穩(wěn)定劑直接在水相中合成量子點(diǎn)。巰基試劑對(duì)量子點(diǎn)的穩(wěn)定性及功能化起重要的作用，選擇帶有適當(dāng)官能團(tuán)的巰基化合物作為穩(wěn)定劑，對(duì)于控制量子點(diǎn)的表面電荷與表面特性極其重要，尤其當(dāng)需要水溶性量子點(diǎn)做熒光標(biāo)記時(shí)，穩(wěn)定劑的選擇就更為重要了。1994年，Vomeyer提出用巰基為穩(wěn)定劑合成CdS。這是首次提出用巰基為穩(wěn)定劑合成量子點(diǎn)。1996年Rogach等用水相法成功合成了巰基乙醇和巰基甘油包覆的CdTe量子點(diǎn)，并得到了較咼發(fā)光效率.1998年Gao等用巰基乙酸（TGA）作穩(wěn)定劑，制備出水溶性CdTe量子點(diǎn)。后來Zheng等首先采用水熱法在溫和條件下合成了水溶性CdTe量子點(diǎn)，大大縮短了水相法制備CdTe量子點(diǎn)的時(shí)間，其熒光量子產(chǎn)率也超過了30AFig.1.QD-nnicelleformationandcharacterization.(A)Schematicofsingle-QDencapsulalioninaphospholipidblcck-copolymermicelle.(E)TEMimageofQD-micellesdriedonacarbon-Formvar-coated200-meshnickelgrid.OnlytheQDsinsidethemiceLLecorearevisible.Theparticlesappearevenlyspreadonthesurface.AlthoughsomeclustersoftwotofourQDsarevisible,mostoftheQDsareisolated,suggestingthatamajorityofmicellescontainasingleQD.(C)TEMimagecfthephospholipidlayerobtainedbynegativestainingwith1%PTA(phosphotungstica<id|atpH7.Withthistechnique,boththeQDandthemicellecanbevisualizedatthewmetime.TheQD(darkspot)appearssurroundedby□wlhitediskofjn-^tainedphospholipidsthatstandsoutagainstthestainedbackground.AJECL100CX7EMvva?operatedat80kV.圖3.1998年Gao等用TGA作穩(wěn)定齊U，制備出水溶性CdTe量子點(diǎn)單體，不斷的加熱,CdTe逐漸長大，通過控制加熱時(shí)間，可得到不同粒徑的量子點(diǎn)。水相合成量子點(diǎn)，不僅解決了量子點(diǎn)的水溶性問題,而且采用帶羧基、氨基等的巰基穩(wěn)定劑對(duì)其表面進(jìn)行修飾，使得量子點(diǎn)能與生物分子上的氨基直接偶聯(lián),因而可以直接用于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè).隨著水溶性量子點(diǎn)的性能不斷提高，良好的生物相容性的水溶性量子點(diǎn)有望成為新一代生物熒光探針.三、量子點(diǎn)在免疫層析技術(shù)中的應(yīng)用量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)利用量子點(diǎn)熒光探針做為標(biāo)記物，不僅充分體現(xiàn)了免疫層析技術(shù)的簡便，快速，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，而且展示了量子點(diǎn)的高靈敏度，以及它的熒光特性，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。目前深圳市金準(zhǔn)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司開發(fā)的量子點(diǎn)免疫熒光層析定量測(cè)試平臺(tái) 干式熒光免疫分析儀(KF—Q001—A)是國內(nèi)首創(chuàng)。在此平臺(tái)上研發(fā)的降鈣素原(PCT)定量測(cè)定試劑盒——量子點(diǎn)(QD)免疫熒光層析法也是國內(nèi)唯一一家成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化并取得注冊(cè)證號(hào)(粵械注準(zhǔn)20152400386)的量子點(diǎn)診斷試劑。隨著發(fā)展和應(yīng)用趨勢(shì)，越來越多的生物診斷試劑公司加入了量子點(diǎn)這個(gè)新興行業(yè)。與此同時(shí)，量子點(diǎn)免疫分析技術(shù)也在不斷地發(fā)展與改進(jìn)，就其發(fā)展趨勢(shì)來看，主要有以下幾個(gè)方面：1。 優(yōu)化量子點(diǎn)熒光探針的制備，得到熒光強(qiáng)度高的QDs,檢測(cè)信號(hào)會(huì)隨著QDs的熒光增強(qiáng)而大大提高。單獨(dú)的量子點(diǎn)顆粒容易受到雜質(zhì)和晶格缺陷的影響，熒光量子產(chǎn)率很低，目前廣泛應(yīng)用的是以QDs為核心，用另一種半導(dǎo)體材料包覆形成核殼結(jié)構(gòu)后，如CdTe/ZnS,可將量子產(chǎn)率提高到約50%甚至更高，并在消光系數(shù)上有數(shù)倍的增加，因而有很強(qiáng)的熒光發(fā)射，可大大提高檢測(cè)靈敏度，有利于信號(hào)的檢測(cè).2。 實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。至今已有部分實(shí)驗(yàn)室或公司研制出QDs熒光定量的儀器，從而可以定量檢測(cè)出待測(cè)物的濃度，這將使量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)得到更廣泛的應(yīng)用，打破了傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)不能定量的限制.3。 量子點(diǎn)的多色檢測(cè)。QDs其中一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是具有可精確調(diào)諧的發(fā)射波長。可以通過調(diào)整粒子尺寸來得到不同發(fā)射的熒光QDs,無需改變粒子的組成和表面性質(zhì)。使得