重組質(zhì)粒構(gòu)建(protocol)

重組質(zhì)粒的構(gòu)建（beta版）、引物設(shè)計(jì):選擇合適的載體。酶切位點(diǎn)及其順序（酶切位點(diǎn)的順序一定不能顛倒;注意ATG和stopcodon）。選擇合適的載體。酶切位點(diǎn)及其順序（酶切位點(diǎn)的順序一定不能顛倒;注意ATG和stopcodon）。在NCBI上再次確認(rèn)目的片段的堿基序列。1,使用word排除目的片段里含有的酶切位點(diǎn)，最后確定所使用的酶。上游酶切位點(diǎn)----下游酶切位點(diǎn)2，設(shè)計(jì)引物：primer-up：Primer-down：保護(hù)堿基保護(hù)堿基---首位20個(gè)堿基r一耒尾20個(gè)堿基的反向互補(bǔ)堿基擴(kuò)增產(chǎn)物包3，另設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增CDS區(qū)，引物位于CDS區(qū)之外含完整的CDS區(qū)。引物長(zhǎng)度約20個(gè)堿基。4，核對(duì) 送公司合成。5，對(duì)公司合成的引物快速離心，在超凈臺(tái)按照管子上標(biāo)注的體積加入高壓水（ddH2O）,配成100umol/ul（100uM）,—20°C保存。使用2時(shí)按1：3比例稀釋成25uM工作濃度。二、PCR（P出目的片段）（一）、PCRP出目的片段：PCR（25ul）反應(yīng)體系1ul2.5ulPCR（25ul）反應(yīng)體系1ul2.5ul1ul廠94C5min94C30sec1ulPCRJ58C30sec1ul溫度體系72CXmin0.5ul72C5min18ul>30cycles1%的瓊脂糖膠:大塊2,pcr: <cDNA10xPFUbufferdNTPF'-PrimerR'-PrimerPFUddH2O2（X是根據(jù)片段的長(zhǎng)度設(shè)定，1000bp/min,退火溫度根據(jù)Tm值來計(jì)算，一般低于Tm值5C）3，跑膠、回收:（1），配膠：0.6g瓊脂糖60ml1XTAE0.6ul（待溫度降到50-60C左右時(shí)）

25分鐘后，即可點(diǎn)樣跑膠。（2） ,跑膠：130T50V、25-30分鐘左右。（3） ，紫外燈下觀察，切膠（要帶防護(hù)手套和口罩）4，膠回收（膠回收試劑盒）:按照試劑盒的protocol來做，在膠回收的最后一步，ElutionBuffer預(yù)先在55-65°C溫箱中水浴，放在37°C溫箱中加in。對(duì)膠回收的產(chǎn)物跑膠驗(yàn)證?？山?0ul的體系：回收產(chǎn)物5ul、6xloadingbuffer2ul、ddH2O5ul。三、酶切、鏈接：1,目的片段酶切：（酶切時(shí)間根據(jù)酶的活性,70C15-20min滅活）20ul的體系2，載體酶切：20ul的體系20ul的體系2，載體酶切：20ul的體系廠insert（膠回收產(chǎn)物）10xbufferJdd2H2OEcoRIHindlll（1?2小時(shí)）{Vector（1ug/ul）：10xbufferdd2H2OEcoRIHindlll10ul2ul6ul1ul1ul5ul（總量5ug）2ul11ul1ul1ul為方便以后使用，載體可以一次性多切點(diǎn)。3，酶切時(shí)，首先要核對(duì)一下酶的buffer，有時(shí)雙酶切時(shí)兩個(gè)酶不能共用一種buffer3，4，連接：1ul1ul3ul1ul1ul3ul（2?3ul）1ul4ul10ul體系J10ul體系JinsertT4DNALignasel叫H2O附:LigationsystemDNA片段克隆到質(zhì)粒載體上載體與插入DNA的摩爾數(shù)比例為1:3-10。最佳的摩爾數(shù)比例因載體類型的不同而不同，例如cDNA和基因組DNA克隆載體?？筛鶕?jù)以下公式計(jì)算插入DNA用量：（naofvector）x（kbpsizeofinsert） . hiseit ,.—— xmolarratioof =ligo±insertkbpsizeofvector vector陜例］:載體與插入片段的摩爾數(shù)比例為1:3，如連接反應(yīng)中加入100ng6kb載體，插入片段大小為0.5kb,這時(shí)應(yīng)加入插入片段的量為：

(1OOngvector)*(O.5kbpsizeofnisertj6kbpsizeofvector6kbpsizeofvector感受態(tài)細(xì)菌50ul質(zhì)粒5ul（2?5ul）⑴、冰上30min--熱激：42°C、60秒（30~6°S）--冰上2分鐘⑵、加750ulLB,37C、150rpm、45分鐘。⑶、離心，4500g,5min。吸去上清600u1,余150ul涂板⑷、220rpm、過夜。五、挑克隆六、質(zhì)粒提?。╩ini）（按試劑盒protocol）七、酶切鑒定：廣plasmid：5ul(總量5ug)10xbuffer1ul10u1的體系￡