臨床檢驗遺傳學(xué)：第十一章 臨床免疫檢驗儀器

第十一章臨床免疫檢驗儀器內(nèi)容提要酶免疫分析儀

發(fā)光免疫分析儀放射免疫分儀析儀免疫濁度分析儀時間分辨熒光免疫分析儀

第二節(jié)發(fā)光免疫分析儀

集發(fā)光反應(yīng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合的免疫分析方法采用微量倍增技術(shù)，敏感性高，特異性好，所用試劑安全、穩(wěn)定；檢測范圍廣泛，從傳統(tǒng)的蛋白、激素、酶乃至藥物均可檢測發(fā)展非常迅速，各種相應(yīng)儀器不斷出現(xiàn)，自動化程度也越來越高。發(fā)光免疫檢測技術(shù)的優(yōu)越性-1消除放射性危害無半衰期限制，試劑穩(wěn)定性、有效期延長實現(xiàn)連續(xù)、動態(tài)、重復(fù)測定發(fā)光免疫檢測技術(shù)的優(yōu)越性-2適合于復(fù)合標(biāo)記系統(tǒng)多指標(biāo)測定操作簡單，反應(yīng)快，易實現(xiàn)自動化靈敏度和線性范圍超過以往技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)分類根據(jù)示蹤物檢測的不同而分為：

-熒光免疫測定

-化學(xué)發(fā)光免疫---再根據(jù)標(biāo)記物的不同分：

-化學(xué)發(fā)光免疫分析

-微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析

-電化學(xué)發(fā)光免疫分析

-化學(xué)發(fā)光酶免疫分析

-生物發(fā)光免疫分析臨床以前三者較為常用由化學(xué)反應(yīng)（通常是氧化）產(chǎn)生電子能級處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，后者通過躍遷釋放能量產(chǎn)生光子，從而導(dǎo)致的發(fā)光現(xiàn)象?；瘜W(xué)發(fā)光

（Chemiluminescence）化學(xué)發(fā)光的分類-1酶促化學(xué)發(fā)光：

辣根過氧化物酶系統(tǒng)堿性磷酸酶系統(tǒng)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)非酶促化學(xué)發(fā)光：

吖啶酯系統(tǒng)三氯聯(lián)吡啶釘三價鐵-魯米諾系統(tǒng)草酸酯系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光免疫分析的種類和原理

（一）基本種類1．化學(xué)發(fā)光免疫分析2．微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析3．電化學(xué)發(fā)光免疫分析4．化學(xué)發(fā)光酶免疫分析5．生物發(fā)光免疫分析（二）基本測定方法

根據(jù)發(fā)光反應(yīng)檢測方式的不同可分為

1．液相法反應(yīng)在液相中進(jìn)行，經(jīng)離心或分離措施后，再進(jìn)行測定發(fā)光強(qiáng)度

2．固相法將抗原抗體復(fù)合物結(jié)合在固相載體(如聚苯乙烯管)或分離介質(zhì)上(如磁性微粒球等)，再進(jìn)行測定發(fā)光強(qiáng)度

3．均相法同均相酶免，不需要經(jīng)過離心或分離步驟，即可直接進(jìn)行發(fā)光強(qiáng)度檢測二、發(fā)光免疫分析儀的種類、

工作原理和基本結(jié)構(gòu)(一)全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)采用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)相結(jié)合的免疫分析系統(tǒng)1．儀器測定原理該類分析技術(shù)有兩種方法：-競爭法測定小分子抗原物質(zhì)-夾心法測定大分子抗原物質(zhì)競爭法原理雙抗原夾心法原理1．分析方法及過程發(fā)光信號檢測光敏二極管、光敏電池、光電偶合器（CCD）結(jié)構(gòu)簡單、性能穩(wěn)定主要特點(diǎn)原理光信號光電轉(zhuǎn)換器件電壓或電流信號放大發(fā)光免疫分析基本操作步驟（一步法）

待測樣品標(biāo)記抗體或抗原洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物儀器檢測包被抗體或抗原的反應(yīng)管反應(yīng)20-60分鐘反應(yīng)0-5分鐘發(fā)光免疫分析基本操作步驟（二步法）

待測樣品洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物發(fā)光底物儀器檢測包被抗體或抗原的反應(yīng)管反應(yīng)20-60分鐘反應(yīng)0-5分鐘標(biāo)記抗體或抗原洗滌去除未結(jié)合的反應(yīng)物反應(yīng)20-60分鐘2．儀器組成一般由微機(jī)和主機(jī)兩部分組成微機(jī)：主要功能為儀器的控制系統(tǒng)，相當(dāng)于人類大腦。主機(jī)：主要為儀器機(jī)械系統(tǒng)，整個儀器的樣本處理、反應(yīng)、檢測，相當(dāng)于人體的軀干。全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)66IMMUNOLOGY（1）微機(jī)系統(tǒng)：1）程控操作2）指示判定3）數(shù)據(jù)處理4）故障診斷5）自動監(jiān)視6）遠(yuǎn)程服務(wù)通過微機(jī)系統(tǒng)可以實現(xiàn)如下功能：設(shè)置系統(tǒng)輸入患者、質(zhì)控和校準(zhǔn)申請查看患者結(jié)果、質(zhì)控數(shù)據(jù)和校準(zhǔn)結(jié)果控制處理模塊和樣本處理器執(zhí)行系統(tǒng)診斷和保養(yǎng)程序從LIS電腦接收檢驗測試申請傳送結(jié)果到LIS電腦通過遠(yuǎn)程硬件與設(shè)備廠家服務(wù)器連接，實現(xiàn)遠(yuǎn)程診斷（2）主機(jī)部分：1）樣本系統(tǒng)2）試劑系統(tǒng)3）反應(yīng)系統(tǒng)4）供應(yīng)系統(tǒng)1）樣本系統(tǒng)

用于存放、識別、遞送校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和患者樣本給處理模塊吸樣。樣本系統(tǒng)樣本針和移液器注射器清洗站2）試劑組件試劑轉(zhuǎn)盤試劑轉(zhuǎn)盤條碼閱讀器試劑移液器試劑探針注射器試劑探針清洗站3）反應(yīng)系統(tǒng)處理軌道轉(zhuǎn)盤和馬達(dá)裝載分流器清洗區(qū)分流器反應(yīng)杯裝載槽和裝載器渦旋混勻器清洗區(qū)預(yù)激發(fā)液與激發(fā)液歧管CMIA閱讀器（光信號檢測裝置）廢液臂4）供應(yīng)系統(tǒng)液體消耗品儲存區(qū)（包括清洗液、底物液、激發(fā)液等）固體消耗品儲存區(qū)（包括反應(yīng)杯、一次性TiP）液體、固體廢品儲存區(qū)(二)全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在新一代實驗室免疫檢測技術(shù)中很有特點(diǎn)，它在20世紀(jì)90年代一問世就引起廣泛的關(guān)注在鏈酶親和素—生物素包被技術(shù)基礎(chǔ)上，引用電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)并開發(fā)出相應(yīng)的全自動電化學(xué)發(fā)光免疫檢測系統(tǒng)1．測定原理及過程：

待測標(biāo)本與包被抗體的順磁性微粒和發(fā)光劑標(biāo)記的抗體共同溫育形成磁性微珠包被抗體—抗原—發(fā)光劑標(biāo)記抗體復(fù)合物吸入流動室，緩沖液沖洗磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被電極下的磁鐵吸引住，而游離的發(fā)光劑標(biāo)記抗體被沖洗走1.測定原理及過程同時在電極加電壓，啟動電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使發(fā)光試劑標(biāo)記物三氯聯(lián)吡啶釘[Ru(bpy)3]2+TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光光的強(qiáng)度與待測抗原的濃度成正比

2．儀器組成及特點(diǎn)

由樣品盤、試劑盒、溫育反應(yīng)盤、電化學(xué)檢測系統(tǒng)及計算機(jī)控制系統(tǒng)組成應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)方法：

-競爭法檢測小分子量蛋白抗原

-夾心法檢測大分子量物質(zhì)

三、發(fā)光免疫分析儀的臨床應(yīng)用

目前主要應(yīng)用于以下幾方面：1．甲狀腺系統(tǒng)(甲狀腺相關(guān)激素、自身抗體)2．性腺系統(tǒng)（性激素、孕檢）3．血液系統(tǒng)（營養(yǎng)相關(guān)葉酸、維生素）4．腫瘤標(biāo)記物5．心血管系統(tǒng)（肌紅蛋白、超敏肌鈣蛋白）6．血藥濃度（強(qiáng)心劑、精神控制藥物）7．感染性疾?。ㄒ腋?、丙肝、優(yōu)生定量）8．其他檢測（IgE、血清皮質(zhì)醇、尿皮質(zhì)醇、尿游離脫氧吡啶等）返回總目錄四：發(fā)光免疫分析儀流水線自動化本節(jié)重點(diǎn)發(fā)光免疫分析儀的種類工作原理和基本結(jié)構(gòu)是什么？第四節(jié)免疫比濁分析儀

現(xiàn)臨床上測定微量蛋白(如Ig等)已發(fā)展到現(xiàn)代自動免疫分析技術(shù)，其靈敏度逐步提高，檢測水平由微克(ug)發(fā)展到納克（ng)，甚至皮克(ps)水平。微量蛋白免疫分析隨著自動化程度不斷提高，在臨床上得到廣泛應(yīng)用，其自動化檢測方法主要為免疫比濁法

根據(jù)檢測原理的不同

有透射比濁法和散射比濁法：

免疫透射濁度測定法免疫透射比濁法免疫膠乳濁度測定法終點(diǎn)散射比濁法免疫散射比濁法速率散射比濁法自動化免疫分析比濁技術(shù)的主要優(yōu)勢(1)穩(wěn)定性好，敏感性高，便于進(jìn)行室內(nèi)及室間質(zhì)控

(2)分析簡便、快速，便于及時將信息向臨床反饋，利于大批量樣品的處

(3)避免標(biāo)本之間的污染及標(biāo)本對人的污染

(4)標(biāo)本用量少一、免疫比濁測定的基本原理

光路示意見圖：1、免疫透射比濁測定原理：

抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過剩時，形成的復(fù)合物隨抗原增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加。2、免疫膠乳濁度測定法原理：

選擇一種大小適中、均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時，則發(fā)生凝集。單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光線可透過。當(dāng)兩個膠乳顆粒凝集時，則使透過光減少，這種減少的程度與膠乳凝聚成正比。（二）激光散射濁度測定基本原理

激光散射光系沿水平軸照射，碰到抗原—抗體復(fù)合物時，導(dǎo)致光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)0o—90o，其偏轉(zhuǎn)角度因光線波長、離子大小不同而有所區(qū)別。散射光的強(qiáng)度與抗原—抗體復(fù)合物的含量成正比，和散射夾角成正比，和波長成反比。1、終點(diǎn)散射比濁法

在抗原—抗體反應(yīng)達(dá)到平衡時，即復(fù)合物形成后作用一定時間，通常為30-60分鐘，復(fù)合物濁度不再受時間的影響，但又必須在聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前進(jìn)行濁度測定。因此，散射比濁法是測定抗原與抗體結(jié)合完成后測定其復(fù)合物的量。2、速率散射比濁法

速率是指抗原—抗體結(jié)合反應(yīng)過程中，在單位時間內(nèi)兩者結(jié)合的速度速率散射比濁法是在抗原與抗體反應(yīng)的最高峰(約在1分鐘內(nèi))測定其復(fù)合物形成的量，該法具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)散射比濁的特點(diǎn)1.不受離心力的沉淀干擾2.受可溶性復(fù)合物干擾小3.受血清指數(shù)的影響小4.快速、準(zhǔn)確、靈敏度和特異性好國內(nèi)常用的激光散射濁度測定儀(一)、ARRAY特種蛋白分析測定系統(tǒng)由微電腦控制，可以定量檢測體液中微量蛋白的全自動組合儀器。

儀器主要部件（1）散射測濁儀

光源采用雙光源碘化硅晶燈泡(400-620nm)

（2）加液系統(tǒng)

具有液體感知裝置，控制加液體積的準(zhǔn)確性（3）試劑和樣品盤

（4）閱讀器

讀取卡片內(nèi)貯存的參數(shù)

（二）DBl00特種蛋白分析測定系統(tǒng)

1、儀器組成DB100特種蛋白分析測定系統(tǒng)，由分析儀、計算機(jī)打印機(jī)、條碼讀取器四部分組成。分析儀是該系統(tǒng)的主要部分，包括：

（1）散射測濁儀光源采用發(fā)光二極管(840±25nm)；化學(xué)反應(yīng)在塑料杯中進(jìn)行；由固體硅探頭監(jiān)測反應(yīng)過程