高效液相色譜在食品分析中的應(yīng)用

高效液相色譜在食品分析中的應(yīng)用

高效液相色譜法（hplc）也稱為高效液相色譜法。根據(jù)經(jīng)典的液相色譜法，在20世紀(jì)60年代末引入了氣相色譜法，并迅速發(fā)展。HPLC分離效能高、分析速度快、檢測(cè)靈敏度高,能分析高沸點(diǎn),但不能氣化熱不穩(wěn)定的生理活性物質(zhì),基于這些特性被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)領(lǐng)域。我國(guó)食品的發(fā)展歷史悠久,社會(huì)經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展,人民生活水平不斷提高,食品安全成為人們極為關(guān)注的話題,尤其是近年來食品安全事件頻頻發(fā)生,人們更加強(qiáng)了對(duì)食品的安全意識(shí),這就要求食品分析技術(shù)更加高效準(zhǔn)確。HPLC在我國(guó)食品分析領(lǐng)域的應(yīng)用始于20世紀(jì)70年代末,90年代后期國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中開始將HPLC法列為檢測(cè)食品中的污染物、營(yíng)養(yǎng)成分、添加劑、毒素和無(wú)機(jī)成分等的國(guó)標(biāo)方法。筆者主要概述了HPLC在食品分析領(lǐng)域的應(yīng)用。1延長(zhǎng)食品保藏期食品添加劑可以提高食品質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,改善食品感觀性質(zhì),防止食品腐敗變質(zhì),延長(zhǎng)食品保藏期等。目前,我國(guó)有20多類、近1000種食品添加劑,合理使用添加劑對(duì)人體健康以及食品都是有益無(wú)害的,但如果不加以限制使用,對(duì)人體健康會(huì)產(chǎn)生危害。1.1定性定量測(cè)定甜味劑是指能夠賦予食品甜味的食品添加劑。按其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可分為營(yíng)養(yǎng)型與非營(yíng)養(yǎng)型甜味劑,通常所講的甜味劑系指人工合成的非營(yíng)養(yǎng)型甜味劑,如糖精鈉、環(huán)己氨基磺酸鈉(甜蜜素)、乙酰磺胺酸鉀(安塞蜜)和天冬酰苯丙氨甲酯(甜味素和阿斯巴甜)等。目前,糖精鈉價(jià)格低廉,應(yīng)用廣泛,但過量添加會(huì)損害人的健康。丁芳林等采用液相色譜-氣相色譜聯(lián)用技術(shù),SpherigelC18色譜柱,電噴霧負(fù)離子采集模式,甲醇-甲酸-三乙胺緩沖鹽梯度洗脫,定量測(cè)定果凍等食品中安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素含量,結(jié)果加樣回收率為93.19%~100.90%,相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.05%~2.04%。該方法選擇性好,定性定量準(zhǔn)確,分析時(shí)間短,同時(shí)也適用于飲料等其他食品的定性定量檢測(cè)。王敏等采用次氯酸鈉在酸性條件下將甜蜜素轉(zhuǎn)化為氯基環(huán)己烷,正己烷萃取,用ODS-C18柱,乙腈∶水=70∶30(V/V)為流動(dòng)相,于波長(zhǎng)314nm處紫外檢測(cè),采用外標(biāo)法定量測(cè)定。這不僅可大大減少一些樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾,而且測(cè)定限低。對(duì)于固體樣品,最低檢出限可達(dá)2.0mg/kg;對(duì)于干擾少的液體樣品,最低檢出限為0.5mg/L,回收率在70%~110%。費(fèi)賢明等用高效液相色譜-熒光法(HPLC-FLD)測(cè)定了食品中的糖精鈉,最低檢出限在0.005~0.200mg/ml,與高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)相比較,HPLC-FLD法重現(xiàn)性好,準(zhǔn)確度更高,由于FLD的選擇性響應(yīng),降低了對(duì)色譜柱的性能要求,更適合復(fù)雜樣品的快速分析,使其具有比UV法更高的可靠性,是一種較為理想的糖精鈉檢測(cè)方法。1.2防腐苯甲酸和山梨酸含量的測(cè)定常用的防腐劑有苯甲酸及其鈉鹽、山梨酸及其鈉鹽等,因其具有毒性小的特點(diǎn),故國(guó)標(biāo)法中允許一部分食品中加入少量的防腐劑。但防腐劑的富集對(duì)人體機(jī)能會(huì)產(chǎn)生一定的影響,所以食品中防腐劑含量的測(cè)定顯得非常重要。王靜等建立了同時(shí)測(cè)定食品中山梨酸、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸異丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯和對(duì)羥基苯甲酸丁酯HPLC法。采用Diamonsi1-ODS色譜柱,以乙腈、水(磷酸調(diào)pH值為3)、四氫呋喃為流動(dòng)相梯度洗脫,于波長(zhǎng)254nm處紫外檢測(cè),7種防腐劑可以達(dá)到基線分離,加樣回收率為93.3%~100.5%,最低檢出限在0.025~0.500μg。劉二東等研究利用HPLC測(cè)定含乳飲料中苯甲酸的含量。用Zn(Ac)2和KFe(CN)3溶液作為沉淀劑進(jìn)行樣品的預(yù)處理,磷酸鹽緩沖液和甲醇混合溶液為流動(dòng)相,C18色譜柱,于波長(zhǎng)225nm處紫外檢測(cè),方法簡(jiǎn)單快速、靈敏度高,既適用于大部分含乳飲料,也適用于純牛奶的測(cè)定。蘇愛梅采用加沉淀劑沉淀法對(duì)火腿腸樣品進(jìn)行預(yù)處理,過濾后用RP-HPLC法測(cè)定火腿腸中防腐劑苯甲酸和山梨酸的含量。色譜柱為Symetry-C18,以0.02mol/L乙酸銨-甲醇(97∶3)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。苯甲酸和山梨酸濃度在0~0.05g/L范圍內(nèi)線性很好(r=0.9996);山梨酸最低檢出限為0.024g/L,平均回收率為100.4%,RSD為0.68%。1.3聚酰胺反應(yīng)及紅乳酸檢測(cè)目前已經(jīng)公認(rèn)人工合成食用色素應(yīng)逐步限制使用,但值得注意的是,在我國(guó)至今仍有少數(shù)不法商人,超標(biāo)準(zhǔn)使用人工合成食用色素,甚至利用不能用作食品添加劑的染料,嚴(yán)重地危害了人們的健康。張連龍等采用HPLC法測(cè)定保健食品黃金搭檔包衣片中食用合成色素,樣品前處理用粉碎提取法和漂洗法,聚酰胺吸附純化LichrospherC18柱,甲醇-乙酸銨流動(dòng)相梯度洗脫,單波長(zhǎng)或多波長(zhǎng)測(cè)定檸檬黃、靛藍(lán)和誘惑紅3種色素。其線性范圍寬(0~100g/ml),回收率高(91.3%~103.1%),重現(xiàn)性好(RSD=2.11%~5.63%),最低檢出限為2~11ng。其中,尤以粉碎提取法,梯度洗脫,多波長(zhǎng)檢測(cè)效果更佳。宋偉華等建立了凝膠色譜凈化、HPLC法檢測(cè)紅腐乳等含油及著色食品中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的方法。用正己烷或乙酸乙醋∶環(huán)己烷=1∶1(V/V)提取食品中的蘇丹紅,經(jīng)凝膠色譜(GPC)去除樣品中分子量較大的油脂天然色素等干擾物后,用HPLC檢測(cè)。王華等以HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地赤霞珠干紅葡萄酒中花色素苷的組分進(jìn)行了研究,為科學(xué)客觀地鑒定葡萄酒原料品種和其他相關(guān)的研究提供了依據(jù),同時(shí)也為建立葡萄與葡萄酒花色素HPLC指紋圖譜提供了依據(jù)。1.4降壓藥固相食品抗氧化劑是能阻止或延緩食品氧化變質(zhì)、提高食品穩(wěn)定性和延長(zhǎng)貯存期的食品添加劑,添加在食品中的抗氧化劑必須用量得當(dāng),否則會(huì)對(duì)人體造成危害。申世剛等采用RP-HPLC法測(cè)定油炸薯?xiàng)l沒食子酸內(nèi)酯(PG)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、羥基茴香醚(BHA)、4-已基間苯二酚(4HR)、二丁基羥基甲苯和2246含量。其中,PG、TBHQ用50%甲醇(RP-HPLC體積分?jǐn)?shù)1%的冰醋酸)作流動(dòng)相,BHA、4HR、BHT和2246用80%甲醇作流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm,相關(guān)系數(shù)在0.9983~0.9996,最低檢出限為1.0~2.0μg/g,平均回收率均在85%以上。劉宏程等采用基質(zhì)固相分散萃取植物油中抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ和PG,經(jīng)HPLC法進(jìn)行分離。結(jié)果通過基質(zhì)固相分散技術(shù),可減少有機(jī)溶劑的用量,縮短分析時(shí)間,提高分析效率,回收率為85.8%~94.3%,最低檢出限為2ng。俞嘩等采用乙腈提取食用油脂中的抗氧化劑PG、THBP、TBHQ、NDGA、BHA、OG、IONOX-100、DG和BHT,濃縮后用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定其含量,方法最低檢出限:PG、THBP、NDGA、OG和DG為0.5μg/g,TBHQ、BHA、IONOX-100和BHT為1.0μg/g。2hplc在食品中的應(yīng)用2.1hplc法檢測(cè)麥芽糖含量對(duì)于碳水化合物的測(cè)定,HPLC法操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,可同時(shí)測(cè)定各種糖,國(guó)際上已將HPLC法作為酒類糖分含量測(cè)定的仲裁法。林婧燁等采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射測(cè)定龍眼果中水溶性單糖和寡糖組分的種類和含量,采用HypersilNH柱,乙腈∶水=80∶20(V/V)為流動(dòng)相,蒸發(fā)光散射法檢測(cè),分離鑒定的果糖、葡萄糖和蔗糖在25~1000μg/ml范圍內(nèi)與色譜峰面積有良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)品回收率在97%~106%。張雪榮等建立了測(cè)定麥芽糖含量的HPLC法,色譜柱為Alhima氨基柱,流動(dòng)相為乙腈-水(62∶38,V/V),麥芽糖峰與雜質(zhì)峰的分離度為6.09,精密度試驗(yàn)的RSD為0.90%。該法測(cè)定麥芽糖含量具有簡(jiǎn)捷、實(shí)用、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。Bernaardez等用HPLC法測(cè)定了不同種類栗子中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量。首先將樣品冷凍干燥,在體積比為80%的水醇溶液中用超聲波提取糖類,蔗糖的回收率為86%,種類不同的栗子蔗糖含量不同,范圍在65~195g/kg。2.2柱前衍生rp-hplc法氨基酸是生物體中重要的生命物質(zhì),是組成酶和蛋白質(zhì)的基本單元,準(zhǔn)確靈敏地測(cè)定食物中氨基酸的含量具有十分重要的意義。目前,柱前衍生化高效液相色譜法以其靈活和易于推廣的特點(diǎn),逐漸取代了傳統(tǒng)的茚三酮方法,用以檢測(cè)氨基酸。陳悅嬌等選用OPA柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定豆?jié){中的游離氨基酸,采用EclipseXDB-C18反相柱,甲醇和0.05mol/L醋酸鈉線性梯度洗脫,于波長(zhǎng)338nm處紫外檢測(cè),豆?jié){煮制過程中游離氨基酸含量逐步增加,回收率在90.86%~106.05%,各氨基酸都得到了良好的分離。劉霄玲采用柱前衍生法,用C18反相色譜柱分離試樣,經(jīng)HPLC測(cè)定乳制品中16種氨基酸的含量,結(jié)果表明,該方法操作簡(jiǎn)便,重現(xiàn)性好,色譜分離時(shí)間短且分離度好。鄭昕等采用鄰苯二甲醛(OPA)-9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)進(jìn)行氨基酸柱前衍生,RP-HPLC法測(cè)定氨基酸含量。3個(gè)不同濃度梯度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液線性關(guān)系良好,樣品保留時(shí)間絕對(duì)誤差小于0.1min,重現(xiàn)性RSD值低于4%,加標(biāo)回收率均在90%~110%。2.3添加量和分離物的質(zhì)譜質(zhì)量脂肪酸是指一端含有一個(gè)羧基的長(zhǎng)的脂肪族碳?xì)滏?是有機(jī)物。飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸和三脂酰苷油磷脂卵磷脂等,對(duì)人體的健康起到了重要的作用。李國(guó)琛等建立了一種用HPLC法與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MAIDI-IDI-TOF技術(shù)聯(lián)用分析了蛋黃中磷脂粗提物。將從蛋黃中提取的多種磷脂通過HPLC預(yù)先分離,收集各組分后分別進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析得到比較清晰的質(zhì)譜圖。Makahleh等選用RP-HPLC與電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)(C4D)結(jié)合的方法分離測(cè)定肉蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸與亞油酸5種未衍生化長(zhǎng)鏈脂肪酸,采用HypersilODSC18色譜柱,以甲醇-1mmol/L醋酸鈉(78∶22,V/V)為流動(dòng)相,結(jié)果表明,硬脂酸在5~200μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好,其他4種酸線性范圍為2~200μg/ml。將此種方法用于檢測(cè)南瓜、大豆、米糠及棕櫚油中脂肪酸,與標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜檢測(cè)方法相比,簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高。2.4線性范圍和檢出限維生素是維持人體生命活動(dòng)必需的一類有機(jī)物質(zhì),也是保持人體健康的重要活性物質(zhì),如果長(zhǎng)期缺乏某種維生素,就會(huì)引起生理機(jī)能障礙而發(fā)生某種疾病。一般由食物中取得。閏龍寶等建立了嬰幼兒配方奶粉中Vc的HPLC法。采用C18反相色譜柱,流動(dòng)相為甲醇∶6.8g/LKH2PO4水溶液,用鹽酸調(diào)pH值2.3)=1∶99(V/V),檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。方法的最低檢出限為50g,線性范圍為20~200μg/ml,加標(biāo)回收率為80.4%~86.2%。劉必成等建立了測(cè)定黃豆餅粉中B族維生素的RP-HPLC法。采用C18柱,甲醇∶水(含5mmol/LPIC-B6和1%冰醋酸,三乙胺調(diào)pH值3.2)=30∶70(V/V)為流動(dòng)相,于波長(zhǎng)275nm處紫外檢測(cè),苯甲酸為內(nèi)標(biāo)物,VB1、VB2、VB6和VB11的平均回收率為99.35%~100.03%,RSD為0.42%~1.08%。3hplc食品污染物的應(yīng)用3.1回收率、精密度和定量下限農(nóng)藥殘留是由于使用農(nóng)藥而導(dǎo)致的在食品、農(nóng)產(chǎn)品或動(dòng)物飼料中殘留的一定物質(zhì),國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)都有明確的藥物最大殘留量,超過其值有可能對(duì)人體造成危害。李海飛等運(yùn)用HPLC柱后衍生熒光檢測(cè)法,測(cè)定蘋果、梨、桃、葡萄、香蕉和芒果等水果樣品中涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、克百威和甲萘威7種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量,結(jié)果7種農(nóng)藥3種不同濃度平均添加回收率在72.5%~116.2%,最低檢出限為0.0037~0.0074mg/kg。陳輝華等建立了同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中四環(huán)素類和氟喹諾酮類獸藥多殘留的HPLC法。樣品經(jīng)固相萃取小柱凈化,以甲醇-丙二酸+氯化鎂水溶液梯度洗脫,紫外檢測(cè)器檢測(cè)。對(duì)樣品前處理和色譜分析條件進(jìn)行了優(yōu)化,8種抗生素(土霉素、四環(huán)素、金霉素、沙拉沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、環(huán)丙沙星、單諾沙星)在0.1~10.0mg/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好,最低檢出限(S/N=3)為0.011~0.051mg/kg,定量下限(S/N=10)為0.035~0.170mg/kg,平均加標(biāo)回收率為81.0%~96.0%。此外,西維因、多菌靈和狄氏劑等150多種農(nóng)藥都可以用HPLC法進(jìn)行分離或分析,在啤酒中時(shí)有發(fā)現(xiàn)的致癌性很強(qiáng)的亞硝胺類化合物,利用Warters公司開發(fā)的SppakSilica小柱凈化、濃縮樣品、反相色譜法也能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)。3.2方法的檢出限和測(cè)定下限環(huán)境污染物以及在工業(yè)生產(chǎn)中所產(chǎn)生的有毒有害化學(xué)物,如包裝材料等均可通過植物或動(dòng)物進(jìn)入食物鏈,并引起人類的疾病或健康問題。董新艷等建立了一步式氧化鋁柱色譜富集結(jié)合HPLC-FLD分析檢測(cè)法,對(duì)3種天然VE中的高分子量多環(huán)芳烴(PAHS)進(jìn)行分析測(cè)定。樣品通過中性氧化鋁柱色譜富集凈化后,XDB-C18反相色譜柱,乙睛∶水(80∶20,V/V)為流動(dòng)相進(jìn)行分離,8種高分子量多環(huán)芳烴的最低檢出限在0.05~0.45ng/g,定量限范圍為0.18~1.50ng/g。Teng等采用液相-電噴霧質(zhì)譜(ESI/MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)水樣中全氟辛烷磺?；衔?PFOS)和全氟辛烷(PFOA)進(jìn)行了檢測(cè),水樣經(jīng)過固相萃取柱(SPE)后,用HPLC/ESI-MS分析,結(jié)果PFOS及PFOA最低檢測(cè)限分別為0.50、2.00ng/L,回收率分別為88%、75%。3.3測(cè)定組化和測(cè)定檢測(cè)食品中存在多種霉菌毒素,主要的霉菌毒素有黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素和玉米赤霉烯酮等。糧食及食品由于霉變不僅會(huì)造成經(jīng)濟(jì)損失,有些還會(huì)造成誤食人畜急性或慢性中毒,甚至導(dǎo)致癌癥。程樹峰等建立了一種快速檢測(cè)糧食中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的碘柱前衍生-高效液相色譜法。樣品經(jīng)提取液處理后,加入適量碘衍生劑衍生,衍生后進(jìn)行色譜分析,結(jié)果4種黃曲霉毒