酶工程 第十節(jié) 酶與現(xiàn)代生命科學

第十一講酶與現(xiàn)代生命科學20世紀以來，現(xiàn)代生物科學發(fā)展已經(jīng)日益深入到分子水平，日益深入到以生物大分子結構與功能關系來說明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律，現(xiàn)代生命科學的前沿課題如生物信息學、基因組學、結構生物學等無一能離開酶。一、酶是分子生物學研究的重要工具

二、酶是生命科學研究的重要對象

一、酶是分子生物學研究的重要工具

酶是分子生物學研究的重要工具。特別是限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)提供了特異剪切DNA的工具,促進了DNA重組技術誕生,推動了基因工程發(fā)展,成為分子生物學研究的不可缺少的工具.

HindⅡ的識別序列和切割位點

↓

5’---GTPyPUAC–-3’

3’---CAPUPyTG–-5’

↑

限制性內(nèi)切酶在基因工程中的應用

基因工程（geneticengineering），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術。它是根據(jù)人們預先設想，采用酶學的方法，將目的基因（所需要的基因）重組到一個適宜的載體上組成重組子，再將重組子轉(zhuǎn)化到適當受體細胞中進行擴增表達，以達到改造生物細胞的目的的技術。

基因工程的整個過程由工程菌（細胞）的設計構建和基因產(chǎn)物的生產(chǎn)兩大部分組成。前者主要在實驗室里進行，其單元操作過程如下：基因工程的單元操作過程如下：（1）從供體細胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA（包括外源基因或目的基因）和載體分子切開。（2）用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子上，形成DNA重組分子。（3）借助于細胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導入受體細胞中。（4）短時間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞，以擴增DNA重組分子或使其整含到受體細胞的基因組中。（5）篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達的基因工程菌或細胞。

關于限制性內(nèi)切酶

Restrictionendonueleases

限制性核酸內(nèi)切酶簡稱限制性內(nèi)切酶，是一類能識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列并具有專一切割位點的脫氧核糖核酸水解酶。主要存在于細菌、霉菌中，至今已分離到1000種以上，搞清識別序列的有300種以上。

有關限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)的幾個重要實驗

50年代初，Luria和Human在研究T4噬菌體感染作用、Bertani和Weigle在研究

和P2噬菌體與宿主細胞關系時，發(fā)現(xiàn)了細菌內(nèi)限制與修飾現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)了細菌內(nèi)存在限制修飾系統(tǒng)，在這兩個系統(tǒng)中包括限制酶和修飾酶。限制酶能識別并降解與自身無關的外源DNA，而修飾酶則可通過甲基化修飾自身DNA，免被限制酶降解。

Bertani和Weigle大腸桿菌噬菌體感染實驗

Bertani和Weigle在探索

和P2噬菌體與宿主細胞關系時，均提出了噬菌體感染大腸桿菌后，宿主細胞對入侵的噬菌體DNA表現(xiàn)有特異的限制作用。

?CEcoli.CEcoli.CEcoli.K12大量繁殖受到抑制

Meselson和Yuan實驗

噬菌體

?K12和

?C的DNA分別與由K12菌體制備的細胞抽提物保溫，并藉蔗糖密度梯度離心觀察兩種DNA沉降速度的變化。

?K12DNA

?CDNA加入K12菌體制備的細胞抽提物蔗糖密度梯度離心

實驗表明，這種限制的本質(zhì)是宿主細胞K12中存在有能使外來DNA(

?CDNA)有限降解的核酸水解酶。

此后，又進一步證實了大腸桿菌K12中的修飾體系即為甲基化酶，該酶修飾了

?K12DNA上的特異部位，使其不被限制體系的酶切割。結論表明：1965年阿爾伯首次從理論上提出了生物體內(nèi)存在著一種具有切割基因功能的限制性內(nèi)切酶。并于1968年成功分離出I型限制性內(nèi)切酶與修飾酶。證實在細菌內(nèi)存在兩種不同功能但又相關的酶。1970年史密斯從流感噬血桿菌d株中分離出了II型限制性內(nèi)切酶；同年內(nèi)森斯使用該酶降解獼猴腫瘤病毒SV40的DNA，首次完成了對基因的切割，排列了酶切圖譜。從此成為分子克隆技術中不可缺少的工具酶，推動了基因工程的發(fā)展。1978年，上述三人因?qū)ο拗菩詢?nèi)切酶的貢獻獲得諾貝爾獎。阿爾伯(1929～)瑞士微生物遺傳學家

H.O.史密斯(1931～)美國分子生物學家、遺傳學家

內(nèi)森斯(1928～)美國微生物遺傳學家

限制性內(nèi)切酶命名規(guī)則

限制酶的命名從其來源微生物的拉丁名中摘取，即由其屬名的第一個字母(大寫)與種名的第一、二兩個字母(小寫)組成酶的基本命名，若酶的產(chǎn)生菌有株系之分，則有4個或4個以上拉丁字母組成，其第四個字母之后表示株系。如EcoRI來源于Echerichia.coli

RY13BamHI來源于B.amyloliquefaciensHindIIHaemophilus(屬名)Influenzae(種名)d(株系)羅馬數(shù)字限制性內(nèi)切酶命名舉例限制性內(nèi)切酶分類已發(fā)現(xiàn)的限制酶可以分為三類或稱作三型：I、II、III型。他們在酶反應中所需要的輔因子和切割DNA的位點都不相同，而且酶蛋白分子的大小和組成上也有差別。類別反應必須因子專一性活性I型S-腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+識別部位和切點不同，無特定切割位點內(nèi)切甲基化II型Mg2+切斷識別部位或其附近的特定部位只有限制酶活性III型ATP，Mg2+識別部位和切點不同，但切斷特定部位內(nèi)切甲基化限制性內(nèi)切酶分類

二、II型限制性內(nèi)切酶的特性

II型限制酶的識別特異性

回文識別序列II型限制酶的識別序列大多是具有雙重對稱結構性結構,或稱回文序列

(PalindromicSequence)

非典型回文識別序列

回文識別序列被一至幾個其他核苷酸（N）所間隔，得到的是非典型的雙軸對稱性序列。

BglI

GCCNNNN

NGGCMstII

CC

TNAGG

非回文識別序列

也有些限制酶識別序列非回文結構，切割位點在距識別序列5至13個bp處。5’GACGCNNNNN

3’3’CTGCGNNNNNNNNNN

5’例：HgnI

GACGC

有些限制酶可識別多重序列。如：HindII，識別序列為GTPyPuAC，可識別三種序列。GTPyPuACGTCAACGTCGACGTTAACGTTGAC嘌呤（Purine）嘧啶（Pyrimidine）類似的內(nèi)切酶還有AccI、AvaI、BanI、HaeI等，它們的特異性低于單一識別序列的酶。

識別序列的長度與剪切頻率

大部分II型限制性內(nèi)切酶的識別序列長度為4-8個核苷酸。識別長度決定了剪切DNA的頻率（1/4n，n為識別的長度）。識別長度愈長，則切點少、產(chǎn)生片段少而長度長，酶特異性高。

限制酶的切割特異性和酶切片段的末端結構

切割位點專一作為工具酶的限制性內(nèi)切酶有固定的切割位點；

產(chǎn)物具有特定的末端結構當一個DNA分子被限制酶切開后形成兩個末端，全部產(chǎn)物具有相同的末端結構。即一種限制性內(nèi)切酶切割任何DNA只產(chǎn)生一種固定形式的末端結構，在DNA連接酶的作用下，磷酸二酯鍵可以修復而成為一個重組的DNA分子；而不同限制酶則形成不同末端結構。5’-G3’-CTTAA

+AATTC-3’G-5’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

DNA連接酶5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

任何一種限制酶切割DNA鏈時，總是水解核苷酸3’、5’-磷酸雙酯鍵的3’位磷酸酯鍵，使產(chǎn)物的5’端帶磷酸單酯基團，而3’為游離羥基。

由于切割位點不同，所有的限制酶可產(chǎn)生兩類末端結構

①平末端（BluntEnd）指酶切片段為齊頭末端結構。②粘性末端（CohesiveEnd）酶切后DNA片段末端帶有1-4個核苷酸殘基長度的單鏈結構，而片段兩端突出的單鏈具有互補的序列。粘性末端又可分為5‘-粘性末端與

3’-粘性末端。

5’

NOH3’

5’PO4N3’粘性末端3’-粘性末端5’-粘性末端平末端5’-G

AATTC-3’3’-CTTAA

G-5’EcoRI

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-CTGCA

G-3’3’-G

ACGTC-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

有沒有例外？（1）相同的限制性內(nèi)切酶不總是產(chǎn)生匹配的片段A）含多重識別序列的限制酶

如

HindII在順序GTPyPuAC剪切，可產(chǎn)生3種不同類型片段，互相連接的可能性為1/3。B）含非典型識別序列的限制酶如EcoNI在順序CCTNNNNNAGC剪切，N可以是任何核苷酸，由于N的隨意性，往往會產(chǎn)生不廣泛匹配的片段。C）在次理想條件下，限制酶表現(xiàn)出星狀活性，影響正常匹配。

（2）不同的限制性內(nèi)切酶有時可以產(chǎn)生匹配的片段

例：BamHIG

GATCC BclIT

GATCA BglIIA

GATCT這類能產(chǎn)生相同粘性末端而識別特異性不同的限制酶稱作同尾限制酶（Isocaudarner）。同尾限制酶產(chǎn)生的DNA片段可借DNA連接酶互相重組，但新產(chǎn)生的雜合序列將不再被原有的限制酶所識別。5’-G

GATCT-3’

DNA

5’-GGATCT-3’

3’-CCTAG

A-5’

連接酶

3’-CCTAGA-5’

(BamHI片段)(BglII片段)(產(chǎn)生雜合識別序列)

酶反應條件

按手冊或商品說明書反應緩沖液：根據(jù)不同酶使用高、中或低鹽緩沖液。常用的緩沖液選擇Tris-Hcl。同時還要加入Mgcl2

和2-巰基乙醇。反應溫度：一般限制性內(nèi)切酶的反應溫度是37○c。酶活性單位：1個酶活性單位是指一種酶在其最適宜的反應條件下，1小時使1μgλ噬