復(fù)方酮康唑納米乳的制備及穩(wěn)定性研究

復(fù)方酮康唑納米乳的制備及穩(wěn)定性研究

酮康唑是一種廣泛的抗真菌藥物，對(duì)各種真菌都有抗菌和殺菌作用。丙酸氯仿是一種用于調(diào)節(jié)神經(jīng)皮炎、慢性濕疹和瘙癢的外包藥物的外包藥物。丁香酚屬于類酸萘，具有抗菌、謀殺、促進(jìn)透皮吸收等多種藥理活性。以上3種藥物均存在難溶和難吸收的問題。國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上外用劑型主要以軟膏和洗劑為主,存在透皮效果差,作用時(shí)間短等缺陷,導(dǎo)致生物利用度低,應(yīng)用中往往以增加用藥次數(shù)來提高其生物利用度,既增加了藥物對(duì)機(jī)體的毒副作用,又促使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性。納米乳是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑等自發(fā)形成,粒徑為1～100nm的熱力學(xué)穩(wěn)定、各向同性,透明或半透明的均相分散體系。納米乳作為藥物載體具有增容增敏,制備簡(jiǎn)單,穩(wěn)定性好,促進(jìn)吸收,生物利用度高,分散度好,注射無疼痛,粒徑小,分布均勻,緩釋和靶向作用等優(yōu)點(diǎn)。近年來,國(guó)內(nèi)外用納米乳載體對(duì)難溶及藥效低的藥物進(jìn)行改造的研究很多。BabetteB等研制了孕酮O/W型微乳。Hwang等制備了W/O注射用維甲酸微乳。沈錦秋等研制了氟比洛芬酯眼用納米乳-離子敏感型原位凝膠。余東升等制備了黃芪注射液濃縮液微乳。本試驗(yàn)在市場(chǎng)上常見的酮康唑與丙酸氯倍他索的復(fù)方中加入了丁香酚并以納米乳為載體研制出了復(fù)方酮康唑納米乳,不僅提高了藥物的透皮吸收率,彌補(bǔ)了此類藥物現(xiàn)有劑型的不足,而且還加強(qiáng)了治療小動(dòng)物臨床上常見的真菌螨蟲混合感染皮膚病的功效,在藥物生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。1材料和方法1.1主要測(cè)試儀器JEM1230透射電鏡(日本日立電子公司);BS214S電子天平(德國(guó)Satorius公司);TGL-16B臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南新星科學(xué)儀器公司);78HW-1型恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)廠);Nicomp388/ZetaPALS激光粒度測(cè)定儀(ParticleSizingSystem,USA);HITACHI高效液相色譜儀(日本日立電子公司)。HC-188透皮擴(kuò)散儀(天津市正通科技有限公司)。酮康唑(湖北恒碩化工有限公司);丙酸氯倍他索(武漢遠(yuǎn)程共創(chuàng)科技有限公司);丁香酚(恒誠(chéng)天然香料提煉廠);肉豆蔻酸異丙酯(IPM,上海高維實(shí)業(yè)有限公司);聚氧乙烯蓖麻油(RH-40,德國(guó)BASF公司);聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL40,德國(guó)BASF公司);聚山梨酯80(Tween-80)、2-苯乙醇、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、1,2-丙二醇、甘油均為分析醇。SD大鼠,購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2確定和準(zhǔn)備工作1.2.1丁香酚、乙酸乙酯、丁香酚油相酮康唑與丙酸氯倍他索在2-苯乙醇中的溶解度較高,因此將2-苯乙醇作為油相的一部分,丁香酚也可作油相,另外還需加入分子鏈較短的IPM(C14)、乙酸乙酯(C4),原則上油相分子體積越小,溶解力越強(qiáng),油相分子鏈過長(zhǎng)不能形成納米藥物,選擇二者中藥物溶解度較高的做為油相。1.2.2表面活性劑的制備表面活性劑選擇非離子型表面活性劑,即RH-40、EL-40、Tween-80,表面活性劑(SF)/助表面活性劑(CoSF),即Km=5時(shí),將3種表面活性劑與油相按照9∶1～1∶9的比例混勻,在25℃條件下用磁力攪拌器攪拌,逐滴滴加蒸餾水至臨界點(diǎn),觀察各組的變化。選擇液體的外觀呈澄清透明且平行光入射后有丁達(dá)爾現(xiàn)象,通過高速(13000r/min,30min)離心后納米乳穩(wěn)定不分層,通過透射電子顯微鏡觀察和激光粒度儀測(cè)出該乳滴粒徑在1～100nm之間的配比,記錄各組分的質(zhì)量百分比。通過Origin8.0軟件繪制偽三元相圖確定納米乳的形成區(qū)域。見圖1。1.2.3助表面活性劑的選擇助表面活性劑在短鏈醇乙醇、甘油、1,2-丙二醇中選擇較容易形成納米乳的作為助表面活性劑。以油相、表面活性劑、水相為3個(gè)頂點(diǎn),Km=5∶1～1∶1分別做偽三元相圖,確定Km值(圖2)。1.2.4復(fù)方酮康唑納米乳的制備將選出的油與溶有酮康唑、丙酸氯倍他索的2-苯乙醇及丁香酚混勻作為油相,加入選定的表面活性劑與助表面活性劑,在25℃條件下用磁力攪拌器攪拌,逐滴加入配方量的蒸餾水即得復(fù)方酮康唑納米乳。1.3質(zhì)量控制1.3.1粒度和形態(tài)的觀察用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定復(fù)方酮康唑納米乳的粒徑大小。通過透射電子顯微鏡觀察其形態(tài),見圖3、4。1.3.2藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)將復(fù)方酮康唑納米乳以13000r/min離心30min進(jìn)行加速試驗(yàn),分別在室溫、4℃、和37℃條件下考察30d,每隔5d觀察1次,置于日光下照射10d,于1、3、5、10d取樣觀察;分別觀察以上試驗(yàn)中藥物外觀及粒徑有無明顯變化。用高效液相色譜儀在設(shè)定的色譜條件下分別測(cè)定復(fù)方酮康唑納米乳的回收率、精密度及含量,考察其穩(wěn)定性(圖5)。1.4氨基溶膠納米乳外劑1.4.1復(fù)方酮康唑納米乳的檢測(cè)設(shè)復(fù)方酮康唑納米乳組,加2.5%氮酮、5%氮酮的復(fù)方酮康唑納米乳組,復(fù)方酮康唑軟膏組,酮康唑、丙酸氯倍他索、丁香酚混懸液組(各組分濃度與復(fù)方酮康唑納米乳相同)5個(gè)試驗(yàn)組。1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定接收點(diǎn)時(shí)間在接受池和擴(kuò)散池中間移入制備好的鼠皮,加緊后接受池中加入PBS,擴(kuò)散池中加入待試藥液1mL,然后置于37℃循環(huán)水浴中,接受池轉(zhuǎn)子攪拌速度為400r/min,加入樣品后,分別于設(shè)定的時(shí)間間隔:0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12h由取樣口取1mL接受液,同時(shí)補(bǔ)充等體積的PBS,將不同時(shí)間取出的接受液樣品用同樣的色譜條件進(jìn)行吸光度的測(cè)定,代入回歸方程。1.4.3取樣點(diǎn)接受液的測(cè)量透皮接受液中各藥物濃度按方程校正:C=Cn+(V0V)∑i=1n?1CiC=Cn+(V0V)∑i=1n-1Ci式中:C是接受液校正濃度(μmol/L),Cn是第n個(gè)取樣點(diǎn)接受液樣品的實(shí)測(cè)濃度(mg/mL),Σci是第n個(gè)取樣點(diǎn)前實(shí)測(cè)濃度之和,V是接受室體積(即5mL),V0是每次取樣的體積(即1mL)。校正濃度見圖6。體外皮膚滲透速率按Fick’s擴(kuò)散方程計(jì)算:Jss=VA×dcdtJss=VA×dcdt式中:Jss是穩(wěn)態(tài)滲透速率(μg·cm-2·h-1),V是接受室體積(即5mL),A是皮膚有效擴(kuò)散面積(即0.785cm2),c是接受室的校正濃度(mg/L),t是時(shí)間(h),dc/dt是接受液濃度與時(shí)間曲線的直線部分的斜率,穩(wěn)態(tài)滲透率見表1。2結(jié)果與分析2.1油相原料的選擇經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)酮康唑與丙酸氯倍他索在乙酸乙酯中的溶解度高于IPM,因此選擇乙酸乙酯為油相的一部分,最終確定復(fù)方酮康唑納米乳的油相為溶有丙酸氯倍他索與酮康唑的2-苯乙醇、乙酸乙酯、丁香酚混合液?？紤]到2-苯乙醇的皮膚安全用量,未將其與丁香酚作為油相,而又加入了乙酸乙酯,使2-苯乙醇的用量保持在安全范圍內(nèi)。丁香酚其本身作為油相的一部分不僅可降低成本,而且可提高納米乳的載藥量。圖1表明三者均能形成納米乳系統(tǒng),Km=5時(shí),EL-40作為表面活性劑時(shí)形成納米乳的乳區(qū)面積明顯大于其他兩種表面活性劑。因此選擇EL-40為表面活性劑。乙醇、甘油、1,2-丙二醇均可形成納米乳,其中乙醇較其他助表面活性劑在使用很少量時(shí)就可形成,因此選乙醇為助表面活性劑。圖2表明Km=5時(shí)形成的納米乳區(qū)面積最大,確定Km=5∶1?？紤]到減少表面活性劑含量,保證一定載藥量,藥物穩(wěn)定性等綜合因素,將復(fù)方酮康唑納米乳各成分的比例確定為EL-4024.29%、乙醇4.91%、2-苯乙醇4.17%、乙酸乙酯7.33%、酮康唑1%、丙酸氯倍他索0.05%、丁香酚1%、水57.25%。2.2復(fù)方酮康唑納米乳回收率圖3顯示復(fù)方酮康唑納米乳平均粒徑為11.8nm,其中90.6%復(fù)方酮康唑納米乳粒徑介于8.72～28.2nm之間,9.4%介于5.61～7.53nm之間。圖4表明復(fù)方酮康唑納米乳為粒徑大小不均的球形多分散體系乳液。加速離心、光穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)方復(fù)方酮康唑納米乳試驗(yàn)后人保持澄清透明的淡黃色液體狀態(tài),無分層,析出、顏色等外觀變化,粒徑大小無明顯變化。圖5表明,納米乳基質(zhì)對(duì)復(fù)方酮康唑納米乳中各藥物含量測(cè)定無干擾,各藥物之間也互不干擾。以濃度C對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸,得酮康唑、丙酸氯倍他索、丁香酚的回歸方程分別為A=30156C-54276R=0.9995(n=5),A=37380C-7200R=1(n=5),A=8049C+4203R=1(n=5),線性范圍分別為60～220、2～10、5～165mg/L。平均回收率分別為99%,RSD=0.38%;101.5%,RSD=1.03%;98.7%,RSD=0.44%。表明回收率較高。日內(nèi)、日間RSD分別為0.57%和1.03%;1.12%和1.88%;0.69%和1.24%。表明儀器精密度良好。納米乳中主要成分的含量無明顯變化。以上試驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方酮康唑納米乳的穩(wěn)定性較為理想。2.3穩(wěn)態(tài)滲透率測(cè)定圖6表明,無氮酮組與2.5%氮酮組的透皮速率無顯著差異,其與2.5%氮酮組透皮速率高于含5%氮酮組。復(fù)方酮康唑納米乳透皮效果顯著高于混懸液組,復(fù)方酮康唑納米乳中酮康唑和丙酸氯倍他索的透皮效果優(yōu)于復(fù)方酮康唑軟膏中兩成分的透皮效果。由表1中穩(wěn)態(tài)滲透速率可知,酮康唑的穩(wěn)態(tài)滲透率,2.5%氮酮組,5%氮酮組,復(fù)方酮康唑軟膏組,混懸液組分別是復(fù)方酮康唑納米乳組的90%,76.4%,59.8%,53.8%。丙酸氯倍他索的穩(wěn)態(tài)滲透速率,2.5%氮酮組,5%氮酮組,復(fù)方酮康唑軟膏組,混懸液組分別是復(fù)方酮康唑納米乳組的95.28%,75.6%,65.4%,35.4%。丁香酚的穩(wěn)態(tài)滲透速率,2.5%氮酮組,5%氮酮組,復(fù)方酮康唑軟膏組,混懸液組分別是復(fù)方酮康唑納米乳組的95.4%,70.8%,33.6%。結(jié)果表明,復(fù)方酮康唑納米乳的透皮效果明顯優(yōu)于混懸液、復(fù)方酮康唑軟膏和含5%氮酮的復(fù)方酮康唑納米乳,與含2.5%氮酮的復(fù)方酮康唑納米乳的透皮效果相當(dāng)。丁香酚的校正濃度明顯高于其他兩種有效成分,這可能與丁香酚其本身具有良好的透皮性能有關(guān),在復(fù)方酮康唑納米乳中,該成分良好的透皮性能可以提高生物利用度。3阿斯匹林的納米乳皮膚病是小動(dòng)物臨床發(fā)病率較高、病理過程長(zhǎng)、類型和癥狀鑒別難度大的疾病,占臨床病歷的20%,真菌性和寄生蟲性皮膚病較多發(fā),二者往往混合感染。一般情況下,膚病雖不致引起死亡,但治療周期長(zhǎng),易復(fù)發(fā),且可感染人體,應(yīng)引起高度重視。病畜主要出現(xiàn)被毛粗亂,脫毛,瘙癢,皮膚出現(xiàn)痂皮,丘疹等癥狀。嚴(yán)重影響了犬的外觀,尤其是觀賞型犬,給畜主帶來了很大的煩惱。工作犬,如警犬,導(dǎo)盲犬等由于皮膚病的困擾,也會(huì)影響正常工作。目前使用的外用制劑多為軟膏和洗劑,其透皮性能不佳導(dǎo)致治療效果不理想,同時(shí)治療這兩種皮膚病的外用藥物也少有報(bào)道。復(fù)方酮康唑納米乳是治療小動(dòng)物真菌性和寄生蟲性皮膚病混合感染的納米級(jí)外用制劑,可涂抹也可噴灑,使用方便。復(fù)方酮康唑納米乳中的