植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是指植物細(xì)胞或小細(xì)胞聚集在液體培養(yǎng)基中，并在搖勻的河床上進(jìn)行懸掛培養(yǎng)。這些細(xì)胞或小的聚集體來自愈傷組織,某個器官或組織,甚至幼嫩的植株,通過物理或化學(xué)的方法進(jìn)行分離而獲得。與傳統(tǒng)的整株材料相比,植物細(xì)胞懸浮體系由于其分散性好、細(xì)胞形狀及細(xì)胞團(tuán)大小大致相同,而且生長迅速、重復(fù)性好、易于控制等有利因素,被廣泛用于生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)、發(fā)育生物學(xué)及遺傳學(xué)、分子生物學(xué)的研究。它不僅可直接用于原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)、雜交、基因轉(zhuǎn)移、生產(chǎn)次生代謝物等,還可在短期內(nèi)在細(xì)胞水平篩選出預(yù)期突變體,因此,懸浮細(xì)胞培養(yǎng)已成為植物生物技術(shù)中一個最有用的手段之一。20世紀(jì)30年代,White等第1次嘗試著培養(yǎng)離體的西紅柿根尖細(xì)胞并獲得成功,此后相當(dāng)長的一段時期內(nèi)人們致力于植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法的探索。但是直到70年代人們還看不到用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的潛力,其主要制約因素是目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物含量低和細(xì)胞生長速度慢。1975~1985年間,提高懸浮細(xì)胞的生長速度和促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的研究分別展開。最成功的例子是1984年日本的MitsuiPetrochemical公司用生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)了紫草(Lithospermumerythrorthizon)細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。此外,人參皂貳(ginsenosides)、長春花堿(vinblastine)、迷迭香酸(rosmaricacid)、青篙素(artemisinin)等物質(zhì)的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)也達(dá)到了中試水平。這些成功的例子又重新喚起人們對用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)有用次生代謝產(chǎn)物的信心。1胚性愈傷組織的檢測能否成功的建立一個穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮系,主要取決于所誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)是否合適。愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中,常常出現(xiàn)多種類型的愈傷組織,根據(jù)能否發(fā)生體細(xì)胞胚胎而將愈傷組織分為胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織兩種類型。只有胚性愈傷組織才有可能成功地建立胚性細(xì)胞懸浮系。一般能建立懸浮系的愈傷組織表現(xiàn)為表面干燥,小顆粒狀,生長旺盛,質(zhì)地松散,淺黃色。1.1愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為了獲得用于細(xì)胞大量培養(yǎng)的培養(yǎng)物,就要選取植物生長旺盛的部位作為外植體。在外植體的切口處都會出現(xiàn)愈傷組織,但不同的外植體所產(chǎn)生的愈傷組織在顏色、質(zhì)地等方面均有明顯不同。王昌濤等根據(jù)玉米不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生的研究結(jié)果認(rèn)為,僅能從幼胚和莖尖誘導(dǎo)出胚性愈傷組織,轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后可以獲得再生植株,而成熟胚和下胚軸則不能獲得再生植株。谷瑞升等以胡楊為材料進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),葉片或莖段在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d后會有3類愈傷組織形成,第1類為淺綠色愈傷組織,表面帶有白色絨毛,這類愈傷組織多從葉片中下部和靠近培養(yǎng)基的莖段切口部位產(chǎn)生。其細(xì)胞呈圓形,排列整齊、緊密。第2類為淺褐色,水浸狀,多在外植體靠近培養(yǎng)基部位產(chǎn)生,其細(xì)胞多呈方形或圓形,細(xì)胞較大,多液泡化,這類愈傷組織再生能力差,但可進(jìn)行繼代培養(yǎng),并在繼代過程中可在其頂端或邊緣產(chǎn)生第3類愈傷組織。第3類愈傷組織為白色絮狀,略帶粘性,多在葉柄和莖切口處產(chǎn)生,也可由繼代后期的第2類愈傷組織的頂部和側(cè)部產(chǎn)生。其細(xì)胞多呈長形或桿形,首尾相連,細(xì)胞核在桿的頂部。吳雙秀以高山紅景天為材料進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),高山紅景天的子葉最容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織,其他由易到難的次序?yàn)橛兹~、幼莖、葉柄和根。小麥的成熟胚、幼胚、幼穗都可作為外植體誘導(dǎo)愈傷,但3種外植體相比較以幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)量最好。1.2加復(fù)合有機(jī)物培養(yǎng)基培養(yǎng)基的種類很多,但各種培養(yǎng)基都是由無機(jī)鹽、碳源、維生素、氨基酸以及激素等五大類成分構(gòu)成。有時還要附加復(fù)合有機(jī)物如水解酪蛋白等。培養(yǎng)基大多采用MS、B5等培養(yǎng)基,附加激素有生長素NAA、2,4-D和IAA,細(xì)胞分裂素6-BA和KT,赤霉素GA以及TDZ(苯基噻二唑脲)。培養(yǎng)溫度22~28℃,以25℃左右居多;光照強(qiáng)度1500~2000lx,日光燈和白熾燈均可,光照時間10~12h或全黑暗培養(yǎng)。1.3分裂素ba的質(zhì)量濃度一般認(rèn)為,激素是誘導(dǎo)愈傷組織極為重要的因素。生長素和細(xì)胞分裂素對保持愈傷組織的高速生長是必要的。最常用的生長素有IAA、NAA、2,4-D,最常用的細(xì)胞分裂素有KT、BA。它們的質(zhì)量濃度范圍一般在0.01~10mg/L。不同品種和不同外植體需要的激素種類和濃度不同。2,4-D是誘導(dǎo)禾谷類作物愈傷組織中唯一不可缺少的生長調(diào)節(jié)物質(zhì),其作用的適宜濃度范圍為0.50~5.00mg/L,但也有例外。吳雙秀以高山紅景天為材料研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞分裂素BA作為外源植物激素對于誘導(dǎo)高山紅景天愈傷組織是必需的,BA濃度在6~12mg/L,尤其以BA(6mg/L)和IBA(1.5mg/L)的組合時,高山紅景天愈傷組織生長速度最快。1.4培養(yǎng)5d液體培養(yǎng)基的篩選多長的繼代周期最適宜愈傷組織的生長,取決于愈傷組織的生長狀況。不同植物的繼代周期差別很大。禾本科植物適宜的繼代周期為20~40d。時間過久,愈傷組織容易分化或褐化,其誘導(dǎo)率和分化率均會降低。一般條件下,縮短繼代周期或繼代時盡量將愈傷組織攤平,以有利于松脆型愈傷組織的形成。固體繼代次數(shù)是一個關(guān)鍵的因素,隨著繼代次數(shù)的增加,愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)后形成的懸浮系的質(zhì)量會越來越高。固體繼代7次后形成的懸浮系的鮮重增長率、分散程度和圓細(xì)胞率都明顯好于固體繼代2次后形成的懸浮系。激素也會影響繼代過程中的愈傷組織的質(zhì)量。將生長狀態(tài)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)到加有不同濃度的2,4-D和KT的培養(yǎng)基上,2,4-D濃度在1.00~4.00mg/L,KT濃度在0.10~0.20mg/L時愈傷組織狀態(tài)較好。在誘導(dǎo)胚性愈傷組織的過程中,若愈傷組織生長過旺就降低2,4-D的濃度,并適當(dāng)提高KT的濃度,反之則提高2,4-D的濃度降低KT。中、低濃度的生長素與低濃度的細(xì)胞分裂素組合則較好,既有利于細(xì)胞的分裂和增殖,又有利于胚的分化與富集。王影等在小葉楊愈傷組織的誘導(dǎo)與狀態(tài)調(diào)控中發(fā)現(xiàn),2,4-D濃度為3mg/L時,愈傷組織生長速度也較快,由色澤淡黃、鮮嫩的小顆粒組成可以建立起生長速度快、植株分化率高的愈傷組織細(xì)胞無性系。2懸浮細(xì)胞的分離和增殖在懸浮培養(yǎng)中,一個成功的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系必須滿足3個基本條件,一是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物分散性好,細(xì)胞團(tuán)較小,一般由幾十個以下的細(xì)胞組成,但很少有完全由單細(xì)胞組成的懸浮細(xì)胞系;二是均一性好,細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同,懸浮系外觀為大小均一的小顆粒,在倒置顯微鏡下觀察為體積和形狀大致相同的細(xì)胞團(tuán);三是生長速度,懸浮細(xì)胞的量一般2~3d甚至更短時間便可增加1倍。因此,在進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)之前,必須先使愈傷化的細(xì)胞能最大程度的分散,再從中篩選出增殖速度快和含有用成分高的細(xì)胞株。為了從愈傷組織獲得單細(xì)胞和小的細(xì)胞集合體,必須首先獲得疏松的愈傷組織。從繼代培養(yǎng)的愈傷組織中挑選質(zhì)地疏松、色澤淡黃、表面呈現(xiàn)顆粒狀的愈傷組織,接種于含有培養(yǎng)液的三角瓶中(通常溶液占培養(yǎng)瓶體積1/3左右),用鑷子夾碎至比較均勻的小顆粒,置于搖床內(nèi)進(jìn)行懸浮培養(yǎng),1周后用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾,除去大的細(xì)胞團(tuán),加入新鮮培養(yǎng)基開始繼代培養(yǎng)。2.1浮動細(xì)胞培養(yǎng)體系的制備懸浮細(xì)胞的生長具有群聚效應(yīng),細(xì)胞密度太低,懸浮細(xì)胞生長緩慢;細(xì)胞密度過高時,細(xì)胞生長速度過快,細(xì)胞液泡變大,懸浮細(xì)胞容易積累有害物質(zhì),不利于懸浮細(xì)胞系的建立。只有密度合適,才能促進(jìn)細(xì)胞生長,利于培養(yǎng)物的分散,形成細(xì)微的細(xì)胞團(tuán)顆粒,建成胚性細(xì)胞系。小麥的細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)過程中,初始接種量在0.5~1.5g(每40ml培養(yǎng)液)范圍內(nèi),細(xì)胞鮮重和干重的增殖倍數(shù)隨接種量的增加而增加,在1.5g時達(dá)到最大值,而且此時的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中顆粒均勻,顏色鮮艷,分散性好;如繼續(xù)增加接種量,細(xì)胞鮮重和干重的增殖倍數(shù)呈下降趨勢,懸浮培養(yǎng)液也變的渾濁。所以懸浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)過程中,初始接種量以40ml的液體培養(yǎng)基加入1.5g左右的培養(yǎng)物為宜。周春江等對草莓懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的研究表明,當(dāng)草莓懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液的體積為40ml時,適宜的接種量為4~6?ml。從俄羅斯楊穩(wěn)定懸浮系中分別吸取密實(shí)體積為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),7d繼代1次。第3次繼代后的7d,分別測定其PCV、鮮重和干重的增殖數(shù)量,結(jié)果表明,初始接種量為1ml的懸浮細(xì)胞增殖倍數(shù)最高,7d內(nèi)細(xì)胞的PCV、鮮重和干重均增加超過5倍,而且懸浮培養(yǎng)物分散均勻、色澤鮮艷、內(nèi)含物豐富。隨著初始接種量的增加,懸浮細(xì)胞的PCV、鮮重、千重的增殖倍數(shù)均明顯下降,懸浮培養(yǎng)液也越來越渾濁,細(xì)胞液泡化,內(nèi)含物少。2.2懸浮細(xì)胞生長和數(shù)學(xué)模型的檢測懸浮細(xì)胞系的建立過程中,激素是影響細(xì)胞狀態(tài)的重要調(diào)控因素。不含2,4-D的培養(yǎng)液完全不能建立懸浮細(xì)胞系。過低濃度的2,4-D則不利于懸浮細(xì)胞系的分散,高濃度2,4-D雖然能促進(jìn)懸浮細(xì)胞的分裂,但是細(xì)胞液泡化,內(nèi)含物少,不利于體細(xì)胞胚胎的發(fā)育。楊樹懸浮培養(yǎng)液中2,4-D濃度為2~3mg/L時,最適于懸浮細(xì)胞的生長。張喜春等在軟棗獼猴桃的懸浮細(xì)胞系的建立過程中發(fā)現(xiàn),高的2,4-D濃度會降低其單細(xì)胞收獲率。柑橘上,2,4-D極易誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞染色體倍性的變異。在禾本科植物中2,4-D濃度過低會導(dǎo)致生根,而濃度過高不僅不利于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物的生長,還導(dǎo)致其胚性的迅速喪失。小麥在懸浮細(xì)胞系的繼代培養(yǎng)基中2,4-D的濃度以1.00~2.00mg/L為宜,而KT的濃度以0.05~1.00mg/L為宜。當(dāng)KT濃度超過0.10mg/L時,愈傷組織的鮮重和干重呈迅速下降趨勢,細(xì)胞的顏色也變得黯淡,直至出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。激素種類和配比對于培養(yǎng)細(xì)胞的生長和次生代謝物含量的增殖都有極大的影響。草莓的懸浮細(xì)胞隨著生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度的增高細(xì)胞生長量加大,顏色為淡黃色或黃色。當(dāng)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度增至2.0?mg/L2,4-D、1.0?mg/LNAA、0.3mg/LZT時,懸浮細(xì)胞生長受到了明顯的抑制,而且培養(yǎng)液渾濁。因此,在2,4-D0.2mg/L、NAA0.5mg/L,ZT0.1mg/L時細(xì)胞增殖倍數(shù)最大,且細(xì)胞生長為淡黃色,顆粒明顯,培養(yǎng)液較清。2.3細(xì)胞增殖個數(shù)在組織培養(yǎng)中,蔗糖不僅是植物賴以生長的重要碳源,而且也是滲透壓調(diào)節(jié)劑,因而起著十分重要的作用。張潔在草莓的懸浮培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),在0~30g/L時,隨著蔗糖濃度的增加,細(xì)胞增殖倍數(shù)呈上升趨勢,30g/L時,細(xì)胞的增殖倍數(shù)最大;蔗糖濃度超過60g/L,細(xì)胞增殖倍數(shù)呈明顯的下降趨勢。陳琰根據(jù)試驗(yàn)得出小麥的懸浮培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中蔗糖含量以30g/L為宜。鏡檢時發(fā)現(xiàn),蔗糖含量超過30g/L時,懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中含圓球體狀顆粒的大細(xì)胞隨蔗糖含量的增加而增加;而體積小、形狀規(guī)則的細(xì)胞逐漸減少。在蔗糖濃度為120g/L時整個細(xì)胞系中幾乎都是含圓球體的大細(xì)胞。小葉楊懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在3%~5%的蔗糖的液體培養(yǎng)基中最有利于胚狀體發(fā)生,高于8%則胚狀體的發(fā)生頻率很低。2.4有機(jī)添加物對南薯細(xì)胞增殖能力的影響人們早就認(rèn)識到水解酪蛋白、酵母提取物、椰乳、麥芽提取物等有機(jī)附加物有利于離體培養(yǎng)的植物組織和細(xì)胞的生長,而且比加入單一的氨基酸更好。在建立禾本科植物胚性細(xì)胞懸浮系的嘗試中,人們對水解酪蛋白、酵母提取物、椰乳等的作用進(jìn)行了研究,多數(shù)結(jié)果表明這些有機(jī)添加物的確可以促進(jìn)胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的生長、增殖,并可以提高其胚胎發(fā)生能力。但陳克貴等在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺和水解酪蛋白同時加入并未促進(jìn)南薯細(xì)胞的生長速率。王海波認(rèn)為在培養(yǎng)基中加入水解酪蛋白、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸有利于保持培養(yǎng)物鮮艷的色澤,細(xì)胞壁薄而質(zhì)濃。2.5培養(yǎng)過程中細(xì)胞的生長和ph值變化培養(yǎng)過程中懸浮系有最適的pH值。叢林曄等通過對pH值分別為5.8、6.0培養(yǎng)的水稻懸浮細(xì)胞進(jìn)行比較,結(jié)果在pH值為6.0的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞,其密度增長較快,并且,其鮮重增加了4.4倍。培養(yǎng)過程中懸浮細(xì)胞系的生長速率及pH值常發(fā)生變化。草莓懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)基的pH值變化來看,繼代培養(yǎng)1d后,培養(yǎng)基的pH值由5.75迅速下降至4.94,此時細(xì)胞處于緩慢增殖時期,生長相對遲緩。在隨后的幾天內(nèi),細(xì)胞干重和pH值都呈緩慢增加趨勢。5~9d時,培養(yǎng)基的pH值由5.12顯著升高至5.56,細(xì)胞的增殖也隨之明顯加快,正是細(xì)胞對數(shù)生長期。繼續(xù)培養(yǎng)時,懸浮細(xì)胞干重增加不顯著,而pH值則緩慢下降并保持相對穩(wěn)定。2.6懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線能為細(xì)胞繼代周期的確定提供重要的參考數(shù)據(jù)。小麥洛夫林10的試驗(yàn)表明,懸浮細(xì)胞的生長曲線基本呈S形,在開始培養(yǎng)的0~3d,愈傷組織的鮮重和干重增長緩慢,為生長延遲期;5~9d愈傷組織生長速度最快,為指數(shù)增長期,細(xì)胞鮮重、干重迅速增加,說明細(xì)胞分裂和細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)累積處于協(xié)調(diào)一致的發(fā)展過程中;9d以后細(xì)胞的鮮重有少量增加、干重基本穩(wěn)定,且此后培養(yǎng)基變混濁,在瓶壁上開始出現(xiàn)衰敗細(xì)胞,不利于懸浮細(xì)胞系的生長。從第11天開始細(xì)胞干重的增殖倍數(shù)有所下降但漸趨平穩(wěn),鮮重也基本不再增長。另外,瓶壁上的衰敗細(xì)胞也增多。楊樹試驗(yàn)中,在繼代后6d內(nèi),細(xì)胞的密實(shí)體積、鮮重和干重增長量表現(xiàn)出高度同步性。至8d時,懸浮細(xì)胞系細(xì)胞的PCV增加約6倍左右,鮮重增加5~6倍,干重增加也都在5倍以上。8d后,培養(yǎng)物的PCV和鮮重、干重依然有所增長,10