大腸桿菌培養(yǎng)和分離

微生物什么是微生物呢？微生物：形體極小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，凡是肉眼看不見(jiàn)的生物。只有在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下才能看清楚的生物。微生物的類(lèi)群3真菌界(單或多C)：例如酵母菌、霉菌、真菌4單細(xì)胞動(dòng)植物例如草履蟲(chóng)、變形蟲(chóng)，單C藻非細(xì)胞結(jié)構(gòu)1病毒細(xì)胞結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞:2原核生物界(單C)：細(xì)菌、藍(lán)藻、放線菌真核細(xì)胞:微生物的新陳代謝類(lèi)型同化作用：自養(yǎng)型，異養(yǎng)型異化作用：需氧型，厭氧型，兼性厭氧型。自養(yǎng)需氧型：光合細(xì)菌（藍(lán)藻），硝化細(xì)菌等異養(yǎng)需氧型：醋桿菌，真菌，固氮菌等異養(yǎng)厭氧型：乳酸菌，假絲酵母菌等異養(yǎng)兼性厭氧型：酵母菌，大腸桿菌。微生物的作用絕大多數(shù)的微生物對(duì)人類(lèi)無(wú)害，90%以上對(duì)人類(lèi)有利。用途：食品發(fā)酵：酒，醋，醬，酸奶，泡菜，腐乳……制藥：生產(chǎn)抗生素：放線菌和霉菌，

生產(chǎn)酶制劑：治理環(huán)境污染：處理廢水，降解塑料……一、細(xì)菌結(jié)構(gòu)

細(xì)胞壁，細(xì)胞膜，細(xì)胞溶膠，擬核DNA，核糖體，質(zhì)粒，鞭毛等革蘭氏陰性，兼性厭氧，一般對(duì)人體無(wú)害，有些菌株有害，一旦進(jìn)入泌尿系統(tǒng)，都有危害。用途：基因工程受體菌。菌落：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。

大腸桿菌菌落不同細(xì)菌菌落不同實(shí)驗(yàn)一

大腸桿菌的培養(yǎng)

與分離實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

1細(xì)菌培養(yǎng)：將大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。2細(xì)菌分離：將大腸桿菌從液體培養(yǎng)基中接種到LB固體培養(yǎng)基，形成單菌落。目的為了分離純化。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

1細(xì)菌培養(yǎng)：用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌。2細(xì)菌分離：用LB固體培養(yǎng)基劃線分離，形成菌落。實(shí)驗(yàn)過(guò)程Ⅰ準(zhǔn)備階段：1培養(yǎng)基配制（兩種），培養(yǎng)皿，培養(yǎng)用到的各種接種工具清洗，滅菌，2操作環(huán)境滅菌，3操作人員消毒Ⅱ操作階段：培養(yǎng)基成分（culturemedia）

按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出的供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。營(yíng)養(yǎng)成分：碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、水和無(wú)機(jī)鹽。培養(yǎng)基成分細(xì)菌:真菌:“喜葷”,蛋白胨,牛肉膏,酵母提液,Nacl等“喜素”,無(wú)機(jī)物或蔗糖溶液配置的豆芽汁LB培養(yǎng)基的配方培養(yǎng)基成分各成分的量蛋白胨0.5g酵母提取物0.25gNaCl0.5gH2O加至50ml1配制培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作

碳源：酵母提取物和蛋白胨

氮源：蛋白胨Nacl的作用：維持滲透壓

培養(yǎng)基配置流程：

計(jì)算-稱(chēng)量-溶解-定容-調(diào)ph--滅菌蛋白胨酵母提取物培養(yǎng)基的種類(lèi)

按照物理性質(zhì)劃分培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基（加瓊脂）液體培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基能形成菌落，用途：微生物的分離、鑒定、保存、計(jì)數(shù)等主要用于擴(kuò)大培養(yǎng)固體培養(yǎng)基瓊脂？紅藻中提取的多糖,在98℃以上熔化，44℃以下凝固，常溫下凝結(jié)成有彈性的凝膠。凝固劑

瓊脂濃度的多少?zèng)Q定了培養(yǎng)基的硬度。培養(yǎng)基配置步驟計(jì)算稱(chēng)量：配固體培養(yǎng)基時(shí)還需加瓊脂溶化：加熱溶化，定容調(diào)節(jié)PH滅菌

細(xì)菌6.5-7.5中性偏堿真菌5.0-6.0中性偏酸培養(yǎng)工具的滅菌玻璃制品：試管、培養(yǎng)皿、三角瓶、移液管、玻璃刮刀塑料制品：取樣器槍頭金屬制品：接種環(huán)，鑷子、棉花：用來(lái)制作棉花塞。棉花塞：透氣，又過(guò)濾細(xì)菌，不能用脫脂棉。高壓蒸汽滅菌法：儀器：高壓蒸汽滅菌鍋121℃1kg/cm215min計(jì)時(shí)：達(dá)到設(shè)定的壓力或溫度都開(kāi)始計(jì)時(shí)使用步驟：先加熱排氣再達(dá)壓力后滅菌15min后關(guān)閉電源，冷卻，待鍋內(nèi)外壓力相同時(shí)才能打開(kāi)。高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌法為濕熱滅菌法，其優(yōu)點(diǎn)有三：

1、濕熱滅菌時(shí)菌體蛋白容易變性；

2、濕熱穿透力強(qiáng)；

3、水蒸汽變成水時(shí)可放出大量熱增強(qiáng)殺菌效果，因此，它是效果最好的滅菌方法。滅菌的方法1、高壓蒸汽滅菌（最常用）培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿，無(wú)菌水，各種玻璃制品2、灼燒滅菌接種環(huán)，玻璃刮刀（使用過(guò)程中），試管口等3、干熱滅菌（160-170℃下加熱1-2h。）金屬制品玻璃砂漏斗4.過(guò)濾滅菌法(不能高溫加熱的物質(zhì))儀器：G6玻璃紗漏斗物質(zhì)：葡萄糖，尿素，抗生素等微生物培養(yǎng)：無(wú)菌操作技術(shù)獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌的入侵，無(wú)菌技術(shù)圍繞著如何避免雜菌的污染展開(kāi)。超凈臺(tái)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作

2滅菌和消毒無(wú)菌操作目的：為了避免被雜菌污染。1對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間：超凈臺(tái)：紫外線滅菌，過(guò)濾風(fēng)桌面：酒精擦拭，酒精燈外焰附近操作2.操作者衣服和手進(jìn)行：清潔和消毒，70%酒精3.避免已滅菌處理的材料用具和周?chē)锲返慕佑|消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法

70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用70%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒4、氯氣、高錳酸鉀消毒……

（1）消毒：

利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過(guò)程。消毒與滅菌的區(qū)別

（2）滅菌：

滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。

以化學(xué)劑或物理方法消滅所有微生物，包括所有細(xì)菌的繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而達(dá)到完全無(wú)菌的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離超凈臺(tái)上紫外燈和過(guò)濾風(fēng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程：準(zhǔn)備階段：1培養(yǎng)基的配制，2滅菌和消毒操作階段：1倒平板：分裝固體培養(yǎng)基倒平板：將已滅菌的固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿的過(guò)程。

分裝培養(yǎng)基：1倒平板：

將滅菌后的固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿培養(yǎng)基冷卻到60度時(shí)倒入2培養(yǎng)基的分裝（試管，三角瓶，培養(yǎng)皿）倒入三角瓶和試管（漏斗法）1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問(wèn)題討論

答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？

答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。操作一：LB液體培養(yǎng)：

擴(kuò)大大腸桿菌數(shù)量條件：37℃，搖床上，振蕩培養(yǎng)2：接種①劃線分離法

平板劃線分離法

原理：接種環(huán)沾菌液后再固體培養(yǎng)基劃線，劃線過(guò)程中菌液逐漸減少，細(xì)菌也減少，最后，細(xì)菌間距離增大，培養(yǎng)后形成單菌落。問(wèn)題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。稀釋涂布平板法1稀釋2涂布固體培養(yǎng)基：涂布分離形成的菌落3培養(yǎng)：37℃恒溫培養(yǎng)

儀器：恒溫培養(yǎng)箱3.進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)，為什么要將平板倒置？

答：防止冷凝水低落影響菌落形成而達(dá)不到分離的目的。因此，恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)皿必須倒置。分離純化大腸桿菌的方法兩種：稀釋涂布平板法和平板劃線法實(shí)驗(yàn)1