差速離心-蔗糖襯墊法提取柑橘線粒體dna

差速離心-蔗糖襯墊法提取柑橘線粒體dna

線條是一個重要的細胞。它相對獨立于遺傳物質(zhì)的dna（mtsda）。根據(jù)大量遺傳、細胞學(xué)和生物化學(xué)研究，細胞瘤（cm）的遺傳因素主要分布在粒度中。因此，植物線條和植物陣線各組的高效化學(xué)分離是植物朱元璋分子機制的基礎(chǔ)。目前用于高等植物mtDNA提取的方法有不連續(xù)蔗糖梯度超速離心法和差速離心法等。不連續(xù)蔗糖梯度超速離心法得到的線粒體DNA雖純度高,但操作復(fù)雜、產(chǎn)率低,特別在吸取中間層黃色液時比較困難,不宜廣泛采用,且長時間高速離心對離心機亦要求很高;普通的差速離心雖然操作簡單,但所提取的mtDNA純度低、易降解,以及核DNA、RNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染嚴重,不能滿足后續(xù)研究工作的需要。本研究以柑橘胚性愈傷組織為材料,建立了一套快速高效的柑橘線粒體DNA提取方法,所提取的線粒體完整,具有很強的熒光活性;此方法提取的線粒體DNA,不但產(chǎn)率高、結(jié)構(gòu)完整,而且能有效去除核DNA、RNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),能夠滿足后續(xù)研究需要,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。1材料和方法1.1主要節(jié)點為陽無核哌柑,其重點在于格局4.本研究所選用的7份柑橘胚性愈傷組織材料和活體材料均取自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室柑橘課題組和國家柑橘育種中心試驗基地,即(1)黔陽無核椪柑(CitrusreticulataBlanco),(2)江西無核椪柑(C.reticulataBlanco),(3)國慶1號溫州蜜柑(C.unshiuMarc.),(4)國慶4號溫州蜜柑(C.unshiuMarc.),(5)伏令夏橙(C.sinensisOsbeck),(6)紐荷爾臍橙(C.sinensisOsbeck),(7)朋娜臍橙(C.sinensisOsbeck)。1.2線條的分離和純度1組織粗粒沉降取培養(yǎng)15d左右正處于分裂期的胚性愈傷組織或葉片、黃化苗50g左右,加入3倍體積預(yù)冷的勻漿緩沖液A(0.2mol/L蔗糖、0.3mol/L甘露醇、50mol/LTris-Cl、1mol/LEDTA、0.1%BSA、0.6%PVP、0.1%β-巰基乙醇,pH7.5),將預(yù)冷的組織用高速勻漿搗碎機破碎組織,低速2次,每次5s,高速3次,每次8～10s;10min后加入2倍體積緩沖液B(蔗糖0.3mol/L、50mol/LTris-Cl,pH7.5),靜置20min,經(jīng)4層紗布過濾,分裝于8個50mL無菌離心管中;取濾液以3000r/min和4000r/min各離心10min,以除去組織碎片和質(zhì)體;將上清液轉(zhuǎn)入新的無菌離心管中,13000r/min離心10min,棄上清,得到粗線粒體沉淀;在每管沉淀中加入緩沖液C(50mol/LTris-Cl、0.3mol/L甘露醇、0.2mol/L蔗糖、0.1%BSA、0.6%PVP,pH=7.5),用毛筆輕刷沉淀使之充分懸浮后收集至50mL無菌離心管內(nèi)。2dnase純化懸浮液4000r/min離心10min,上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中,加入DnaseⅠ至終濃度25μg/g,同時加入終濃度為0.01mol/L的MgCl2,冰上反應(yīng)2h。在冰浴液中加入EDTA至終濃度20mol/L,終止DNaseⅠ反應(yīng);將此溶液小心置于20mL0.6mol/L蔗糖介質(zhì)上(0.3mol/L甘露醇、50mol/LTris-Cl、0.6mol/L蔗糖,pH7.5),13000r/min離心10min。棄上清,沉淀中加入0.1mL/g的緩沖液C,輕輕懸浮均勻,再次將此溶液小心置于20mL0.6mol/L蔗糖介質(zhì)上,13000r/min離心20min,所得沉淀即為純化的線粒體。上述操作均在2～4℃條件下進行。具體操作根據(jù)參考文獻略作改動。1.3提取和提取瘦粉酶dna1rnasea酶液制備在線粒體沉淀中加入0.1mL/g緩沖液D(0.1mol/LTris-Cl、50mol/LEDTA、0.1mol/LNaCl、5%SDS、0.01mol/Lβ-巰基乙醇,pH7.5)輕輕混勻沉淀,再加入蛋白酶K至終濃度10μg/g,于65℃裂解1h,每隔10min輕輕搖動1次;加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)緩慢混勻,靜置5min后,于4℃下10000r/min離心10min;取上清,加入RNaseA酶液至終濃度為100μg/mL,于37℃反應(yīng)1h;加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1),同時加入100μLKAc緩慢混勻,室溫放置5min后,10000r/min離心10min;重復(fù)該步驟直至液面白色物質(zhì)消失為止.2無定形法提取布放液液將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中,加入2倍體積的無水乙醇,充分混勻。將混合液分裝到14個1.5mL無菌離心管內(nèi),-20℃過夜;將過夜的混合液在10000r/min、4℃條件下離心10min得到純度較高的線粒體DNA;然后用70%酒精洗滌,線粒體DNA室溫晾干后溶于30μLTE中,4℃保存?zhèn)溆谩＞唧w操作根據(jù)參考文獻略作改動。1.4線條活性、線條dna質(zhì)量和活性測試1物鏡下觀察取2μL純化后的線粒體,以緩沖液B稀釋20倍后取少量于40倍物鏡下觀察。其余稀釋液加入熒光素(fluoresceindiacetateFDA)染色,吸少許滴到載玻片上,輕覆蓋玻片,置于倒置熒光顯微鏡下進行熒光激發(fā),觀察照相以檢測線粒體活性。2紫外分光光度計檢測取10μLmtDNA溶液,加超純水稀釋至3mL,用紫外分光光度計分別測定A260nm/A280nm、A260nm/A230nm及mtDNA濃度,并進行純度分析。31測定了線條dna活性取5μLmtDNA樣品,0.7%瓊脂糖凝膠電泳90min(電壓80V)。用凝膠成像系統(tǒng)照相檢測mtDNA。1.5pcr擴增mtndaRAPD擴增體系參照文獻介紹的方法。PCR反應(yīng)體系為0.1mol/LdNTP;2mol/LMgCl2;0.4μmol/L引物;1.5UTaq酶;25ngmtDNA,總體系為25μL/管。PCR擴增程序為95℃3min1個循環(huán);94℃1min,37℃1min,72℃2min45個循環(huán);72℃5min1個循環(huán);保存溫度4℃。擴增反應(yīng)在PTC-100(BIO-RAD,USA)上進行。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳緩沖液中,95V下電泳1h,然后在UVP成像系統(tǒng)(BIO-RAD,USA)上成像。2結(jié)果與分析2.1胚性愈傷組織的提取FDA是一種非極性物質(zhì),可被活細胞滯留,熒光激發(fā)后發(fā)出黃綠色熒光,若細胞有損傷則會從細胞中流失,觀察不到熒光。本研究應(yīng)用FDA染色來檢測柑橘線粒體活性,40×光學(xué)顯微鏡下可觀察到橢圓形的線粒體。線粒體經(jīng)熒光素染色后熒光激發(fā)呈綠色(圖1),說明提純后的線粒體是完整的,具有一定的活性。應(yīng)用本研究的方法從葉片(包括幼嫩葉片和成年態(tài)葉片)、黃化苗及胚性愈傷組織均可分離出線粒體,但進一步提取DNA發(fā)現(xiàn):以葉片為材料獲得的mtDNA量少、雜質(zhì)多,且極易降解,即使用傳統(tǒng)的純化線粒體的方法(CsCl2超速離心),仍很難避免葉綠體DNA的污染。黃化苗雖然能夠獲得質(zhì)量較高的mtDNA,但由于試材均為雄性不育品種,果實幾乎無種子,黃化苗的獲得較困難。而以胚性愈傷組織作為提取線粒體的材料,易擴繁,且能排除葉綠體DNA的污染,提取的mtDNA產(chǎn)率及質(zhì)量均較高。從紫外分光光度計測定結(jié)果(表1)表明:以胚性愈傷組織提取的mtDNAA260nm/A280nm介于1.87～1.90之間,表明樣品中無蛋白質(zhì)或酚類污染,純度較高,能夠滿足分析要求。樣品平均濃度為1.90μg/μL,平均每克胚性愈傷組織可提取mtDNA1.90μg,即取30～50g胚性愈傷組織提取的mtDNA能滿足分子標(biāo)記技術(shù)分析研究的需要。mtDNA瓊脂糖凝膠電泳觀察到的帶型清晰,mtDNA片段大小為20kb左右,未出現(xiàn)降解情況,無拖尾、彌散(圖2),說明本方法能夠得到純度較高的大片段mtDNA片段。影響mtDNA提取產(chǎn)率的因素主要是線粒體的裂解程度。本研究發(fā)現(xiàn)5%SDS的裂解液與蛋白酶K一同處理效果最好,可能是因為高濃度的SDS與蛋白酶K共同作用更容易使線粒體膜裂解,利于mtDNA釋放。同時,為了維持一定的滲透壓,保證釋放出的線粒體膜的完整性,筆者在緩沖液中加入了一定量的甘露醇,避免了在操作過程中線粒體提前裂解。用于mtDNA純化的方法主要有KAc去除蛋白質(zhì)法和有機溶劑去除蛋白質(zhì)法等,但本試驗采用這些方法效果并不理想。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上,對有機溶劑去除蛋白質(zhì)的方法加以改進,即在V氯仿∶V異戊醇=24∶1抽提的同時加入100μLKAc,該方法能夠較好地去除mtDNA中的蛋白質(zhì),所提取的mtDNA含雜質(zhì)少,純度較高。通過比較裂解溫度和時間對mtDNA產(chǎn)率的影響,發(fā)現(xiàn)線粒體裂解時,在其他裂解條件不變的情況下,65℃裂解1h,所得到的mtDNA沉淀明顯增多,原因可能是高裂解溫度使線粒體破裂程度發(fā)生改變,從而引起mtDNA更多地釋放出來。2.2rapd分析以黔陽無核椪柑、伏令夏橙和葡萄柚mtDNA為材料篩選合適的引物。對30條前期初篩的多態(tài)性好的隨機引物進行篩選,其中14條引物擴增產(chǎn)物帶型清晰,具有較好的多態(tài)性(圖3)。本研究利用篩選出的14條引物對7份供試材料進行RAPD分析,獲得的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后具有較好的多態(tài)性,大小在250～2000bp之間,且?guī)颓逦?無拖尾現(xiàn)象(圖4);共獲得53條清晰的多態(tài)型帶,每個引物擴增出1～6條譜帶,平均為4條。研究發(fā)現(xiàn),7份供試材料均能產(chǎn)生相同的擴增片段,說明mtDNA在進化上存在保守性序列,差異性擴增譜帶的出現(xiàn),說明各品種在mtDNA的堿基序列上存在多態(tài)性,品種之間存在進化關(guān)系。3rapd技術(shù)植物雄性不育性狀是一種由細胞質(zhì)基因控制的母性遺傳性狀,其實現(xiàn)是一個極其復(fù)雜的過程。從發(fā)現(xiàn)至今,人們對其發(fā)生機理的探索從未停止過,分子生物學(xué)的發(fā)展為人們從本質(zhì)上認識CMS提供了有利的手段。國內(nèi)外研究結(jié)果均表明,植物細胞質(zhì)雄性不育與mtDNA變異有著密切的關(guān)系。但是,在植物中由于植物細胞具有細胞壁、大液泡和葉綠體DNA干擾,使mtDNA分離難度大大增加,因此,許多研究者亦從總DNA方面對胞質(zhì)雄性不育進行了研究。該方法雖然能夠說明部分問題,但是與胞質(zhì)基因組相比,其結(jié)果不夠直接、可靠。高等植物線粒體基因組的大小約為200～2500kb,結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,存在大量的內(nèi)含子、重復(fù)序列及非編碼序列,不同于動物中只含有調(diào)控區(qū)和編碼序列的線粒體基因組。在分子水平上對線粒體進行研究不僅能找出不同物種之間的親緣關(guān)系,還可以克隆與某種特異現(xiàn)象有關(guān)的線粒體基因。目前用于mtDNA提取的方法主要有氯化銫梯度超速離心法、蔗糖密度梯度離心法和差速離心法等。氯化銫梯度超速離心法獲得的mtDNA純度高,可以在一定程度上避免葉綠體DNA的污染,但是該方法費用較高,不適合普通實驗室操作;蔗糖密度梯度離心得到的mtDNA純度雖高,但操作復(fù)雜、耗時、對材料的需求量大,同時mtDNA的產(chǎn)率低,且長時間高速離心對離心機的要求也較高;普通的差速離心法雖然操作簡單,但所提取的mtDNA純度低、易降解,且核DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染嚴重,不能滿足后續(xù)研究工作的需要。本研究采用的方法是綜