DB6528T189-2023加工辣椒品種InDel指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建規(guī)范

ICS67.080.01CCSB31

6528巴音郭楞蒙古自治州地方標準DB6528/T189—2023加工辣椒品種InDel指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建規(guī)范ProcessingpeppervarietiesInDelfingerprintdatabaseconstructionspecification.20232023080120230815巴音郭楞蒙古自治州市場監(jiān)督管理局??發(fā)布DB6528/T189DB6528/T189—2023DB6528/T189DB6528/T189—2023目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1InDel標記鑒定程序 2標記類型及標記來源 2檢測方法 2質(zhì)量保證 2DNA質(zhì)量 2引物序列 2酶及PCR反應(yīng)相關(guān)試劑 3PCR擴增反應(yīng) 3樣品的來源及性質(zhì) 3品種來源 3樣品類型 3樣品分析數(shù)量 3引物及流程的評估 3評估用的品種數(shù)量及名單的確定 3引物評估的取舍 4不同來源數(shù)據(jù)的有效整合 4固定一套核心引物 4提供標準品的要求 4提供標準DNA的要求 4確定引物等位基因BIN的要求 4異常帶型的數(shù)據(jù)處理方式 4數(shù)據(jù)的編碼方式 4構(gòu)建品種DNA指紋模式庫 5構(gòu)建品種DNA指紋擴展庫 5數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的隨機盲測 5I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件主要起草人：張建文、張國儒、楊生保、唐亞萍、楊濤、李輝玲、帕提古麗·艾斯穆托拉、火順利、董潔、葉遠榮。本文件實施應(yīng)用中的疑問，請咨詢新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。（新疆庫爾勒市石化大道64號小區(qū)（新疆庫爾勒市英下路巴州農(nóng)科院新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院聯(lián)系電話郵編：841000新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園藝所聯(lián)系電話郵編：830091新疆巴音郭楞蒙古自治州市場監(jiān)督管理局聯(lián)系電話郵編：841000IIII加工辣椒品種InDel指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建規(guī)范范圍本文件規(guī)定了加工辣椒品種InDelDNADNA本文件適用于加工辣椒品種鑒定及DNA指紋庫的建立。規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。InDel標記Insertion-deletion根據(jù)基因組中插入缺失位點，設(shè)計一些擴增這些插入缺失位點的PCR引物，這就InDel標記。DNA指紋DNAfingerprint具有完全個體特異的DNADNAPAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。注：根據(jù)寡核苷酸的大小來分離，因此可將全長產(chǎn)物與不完整的短分子分開，適合變性蛋白的處理。引物primer是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3’-0H上，核苷酸以一酯鏈形式進行合成，因此引物的3’-0H，必須是游離的。核心引物coreprimers指多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等綜合特性好、可作為DNA指紋鑒定優(yōu)先選用的一套引物。注：定性狀進行調(diào)整。標準品種standardvariety1DNA指紋庫構(gòu)建過程中作為譜帶分型的參照標準，并輔助判斷試驗的穩(wěn)定性和可靠性。注：以一套典型的遺傳基礎(chǔ)廣泛的高度純合自交系為試材，對擬建庫的引物進行DNA指紋分析，就可確定代表每個引物不同譜帶的標準品種名單。DNAstandardDNA由一個實驗室統(tǒng)一按規(guī)定的DNA提取方法一次性提取足量的標準品種的DNA，經(jīng)DNA指紋分析驗證其真實的指紋帶型后統(tǒng)一發(fā)放。InDel通過設(shè)計特異性引物并進行PCR（或聚丙烯酰胺凝膠電泳）和放射自顯影（或銀染），可檢測到在簡單重復(fù)序列重復(fù)單位數(shù)不同的DNA區(qū)域的多態(tài)性。標記類型及標記來源采用InDel標記作為加工辣椒DNA指紋庫構(gòu)建的標記方法。檢測方法7質(zhì)量保證DNA質(zhì)量純度要求:OD260/OD280在1.8～2.0之間。7質(zhì)量保證DNA質(zhì)量純度要求:OD260/OD280在1.8～2.0之間。引物序列表1 17對引物序列表2引物編號標記名稱上游引物下游引物InDel16CIDH119AGGAACTAAAAAGTGGTTTTGGGTTCACACACGTCCAACCCAATInDel33CIDH108ACAATCGAAGGGGAGCCTTGTCCTCTGTTTCATGATTCCGACTInDel41CIDH116AGGAGAAAAAGAAAGAACAACCACACGAAGCCCTTCACATTAACGTInDel63CIDH110ACTCTTGGAAGATGGGGTTCACCGAAGTAAAATAGGAAAATTGCCAInDel88CIDH107AGCCCAATAGAAAGATTGCTCACGCTGAATTTTGAAATATTTAGTCTGGInDel137CIDH128ACAAGGAGAAAAGGGGCCTTCTGTATCTCGGCTTAAAGGGGTInDel146CIDH109GGAACCCGACCACCAGAAAATCGCGGGGACTATTTACCCTInde1172CIDH135GGTGGGACCAAAGAGAGTTTTGAACAAGCAAAAGCCAAGA表117對引物序列表（續(xù)）引物編號標記名稱上游引物下游引物InDel200CIDH135ACTCACAGTCCTTAAACTTACAAAACTTGCCACTATAAATCCATCACCGAInDel201CIDH136AGGCACCAGTTAGCTCGAAAAGCGCATCTCAATCTATGTCGAInDel206CIDH113CCTGGAGGCTATGCACCATTATTTGCAGCCACCCAGCATAInDel209CIDH116CGCTACGAGTGGTACCTGACTGGGGATTGCTTCATTGGTGTInDel211CIDH118TCAGTTGTGTCCTGAACCCTACATGCAGAACAAATAGCCCTInDel215CIDH122ACCGTTGACACTTCCATGCTAATCCCCACGTGCAGTTCATInDel219CIDH126CCGAGCATTGAGACCGAGTTAAGCTTTCTGATCCACCCCCInDel228CIDH135TGACACGTGACATTCAGCGTTGACCTACAAACACACTGCTCAInDel234CIDH113AAAAAGGGCAGCTCGGTGTAGAACCCCCTGAAGAGAAGGCPCR對構(gòu)建標準DNA指紋庫時采用的試劑指定供貨廠家及規(guī)格。PCR統(tǒng)一采用相同的反應(yīng)程序及反應(yīng)體系。8樣品的來源及性質(zhì)8樣品的來源及性質(zhì)品種來源品種來源應(yīng)可靠，建庫品種主要來自：——新疆維吾爾自治區(qū)區(qū)域試驗和品種審定委員會審定的品種以及品種權(quán)保護部門保護的品種；——國家種質(zhì)資源庫；——向育種單位直接征集。樣品類型主要包括種子或葉片?？梢蕴峁┤~片等營養(yǎng)組織或提供符合要求的DNA樣品。樣品分析數(shù)量9引物及流程的評估評估用的品種數(shù)量及名單的確定31～2套遺傳上或形態(tài)上極為相似的材料以評估引物對近似品種的區(qū)分能力。引物評估的取舍10不同來源數(shù)據(jù)的有效整合不同來源DNA指紋數(shù)據(jù)的有效整合問題是DNA固定一套核心引物17對引物作為構(gòu)建加工辣椒DNA指紋數(shù)據(jù)庫用的基本核心引物。提供標準品的要求標準品的要求如下：——除了少數(shù)稀有譜帶類型不易找到標準品種時選用特殊自交系外，宜盡量選用國內(nèi)外已知的常用自交系為標準品種；——標準品種應(yīng)純合；——標準品種應(yīng)容易擴繁保種；——標準品種由指定的單位統(tǒng)一擴繁保種，統(tǒng)一發(fā)放；——宜盡量用較少的品種代表較多種譜帶類型。提供標準提供標準DNA的要求提供標準DNA的要求如下：——DNA質(zhì)量符合要求，純度高，OD260/OD280在1.8～2.0之間；——DNA經(jīng)過指紋分析反復(fù)驗證，證明能夠穩(wěn)定擴增出預(yù)期大小的譜帶；——同一批次提取的DNA量要大，大于或等50ug。確定引物等位基因BIN的要求確定引物等位基因BIN的要求如下：——應(yīng)包括主要的等位基因；——如果稀有等位基因也包括在內(nèi)的話，應(yīng)標注其為突變型；——每個等位基因根據(jù)其表現(xiàn)特征，確定其擴增片段大小的區(qū)間范圍。異常帶型的數(shù)據(jù)處理方式異常帶型主要包括：稀有帶型、零帶型、弱帶型、缺失帶型等?！獙ο∮袔蛻?yīng)如實記錄，但應(yīng)標注其為稀有帶型；——對零帶型應(yīng)盡量避免，如果某引物出現(xiàn)的零帶型比率較高（＞5%），則該引物應(yīng)剔除；——對弱帶型及缺失帶型應(yīng)盡可能通過重新擴增將數(shù)據(jù)補齊。數(shù)據(jù)的編碼方式主要有3種：4——根據(jù)擴增產(chǎn)物在電泳凝膠上的相對位置，確定不同的譜帶類型，并按擴增片段從大到小的順序編號。適用于儀器不具有直接讀取片段大小的功能的情況；——根據(jù)擴增產(chǎn)物的片段大小，直接記錄不同譜帶片段大小。適用于儀器具有直接讀取片段大小的功能且同一多態(tài)性位點上采用的引物固定的情況；——將同一多態(tài)性位點設(shè)計的不同引物獲取的數(shù)據(jù)進行整合。適用于在同一多態(tài)性位點同時設(shè)計并使用了多個不同引物進行數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的情況。數(shù)據(jù)整合采取如下兩種方案：采用記錄擴增片段絕對大小的方式。指定某個引物為該多態(tài)性位點的標準引物，該位點設(shè)計的其它引物獲得的數(shù)據(jù)按照片段大小整體向上或向下位移的規(guī)律，統(tǒng)一轉(zhuǎn)換成標準引物的數(shù)據(jù)。有引物的數(shù)據(jù)均以實際片段大小減去該引物擴增的最小片段大小后記錄，因此，同一引物位點無論采用多少不同的引物，所獲得指紋的編碼方式是不變的，但應(yīng)提供該