原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理細(xì)胞培養(yǎng)是用酶消化法將組織碎塊分離成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下，使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。細(xì)胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)主要不同點(diǎn)在于原始培養(yǎng)的對(duì)象不同。細(xì)胞培養(yǎng)使用的是單個(gè)細(xì)胞懸液，組織培養(yǎng)使用的是組織塊（0.5?1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米），而器官培養(yǎng)使用的是器官原基或器官的一部分或整個(gè)器官。在組織培養(yǎng)中，細(xì)胞自組織塊周?chē)瞥霾⑸L(zhǎng)，細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中總有移動(dòng)（運(yùn)動(dòng)）或其它變動(dòng)，這樣就使被培養(yǎng)的組織難以長(zhǎng)期維持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)生變化的可能性越大，結(jié)果常使單一類(lèi)型的細(xì)胞保存下來(lái)，最終成了細(xì)胞培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞生命活動(dòng)和體內(nèi)細(xì)胞一樣，仍然是相互依存的，呈現(xiàn)一定的組織特異性，所以組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)際上無(wú)嚴(yán)格區(qū)別。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)中常用的研究手段，該方法能排除神經(jīng)體液因素的影響及肝、腎解毒功能的干擾，觀察某些因素或藥物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的直接作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可獲得某一類(lèi)型細(xì)胞的純培養(yǎng)。如心肌組織中心肌細(xì)胞約占50%，非心肌細(xì)胞占50%;而經(jīng)純化分離的心肌細(xì)胞懸液中，心肌細(xì)胞可達(dá)95%以上，這樣，心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)基本不受其它細(xì)胞的干擾。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中能直接觀察到培養(yǎng)細(xì)胞生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程；用定時(shí)顯微攝影記錄可發(fā)現(xiàn)一些肉眼觀察不到的生命現(xiàn)象;還可利用電鏡手段、同位素標(biāo)記、放免法和免疫組化法等來(lái)研究細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的分布。此外，還能節(jié)約研究費(fèi)用。如在某些研究中，用100只動(dòng)物做實(shí)驗(yàn)所獲得結(jié)論與用100張蓋玻片或幾十個(gè)培養(yǎng)瓶而獲得結(jié)論具有相同的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而細(xì)胞培養(yǎng)較之大批量的動(dòng)物飼養(yǎng)花費(fèi)要小。但細(xì)胞培養(yǎng)方法也存在不足之處：培養(yǎng)細(xì)胞失去體內(nèi)細(xì)胞的制約和整體的調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞形態(tài)和功能會(huì)發(fā)生一定程度的改變。培養(yǎng)方法、實(shí)驗(yàn)試劑對(duì)細(xì)胞形態(tài)和功能有一定的影響，如胰蛋白酶可破壞細(xì)胞表面受體、酶、抗原等。長(zhǎng)期體外培養(yǎng)的細(xì)胞，由于反復(fù)傳代、凍存和操作等因素的影響，可能發(fā)生染色體非整倍體改變，呈永生化或癌變的特征。細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備與用品（1） 細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備有：CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，凈化臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，自動(dòng)雙重純水蒸餾器，液氮罐，冰箱，電熱干燥箱，電熱恒溫培養(yǎng)箱，電動(dòng)吸引器，抽氣泵等。（2） 常用的實(shí)驗(yàn)用品玻璃器皿細(xì)胞培養(yǎng)所用的玻璃器皿應(yīng)由透明度好、無(wú)毒的中性硬質(zhì)玻璃制成。常用的有以下幾種：國(guó)產(chǎn)螺旋口培養(yǎng)瓶［有12.5毫升，25毫升，100毫升等規(guī)格，國(guó)外培養(yǎng)瓶常以底面積（平方厘米）表示］；培養(yǎng)皿（直徑有3.5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等規(guī)格）；離心管（5毫升，10毫升）；注射器（1毫升，5毫升等）；用生理鹽水瓶代替的貯存瓶（100毫升，250毫升，500毫升）；青霉素瓶（5毫升）；西力辛瓶（10毫升）；其它還有尖吸管和移液管，載玻片（厚度0.8?1.2毫米），蓋玻片（厚度0.12毫米），貯存尖吸筒用的玻璃筒或金屬筒，漏斗，燒杯，量筒，貯蒸餾水瓶，冷凍管（1.5毫升，2毫升）等。塑料品多孔培養(yǎng)板規(guī)格有4、6、12、24、96孔等，培養(yǎng)皿直徑有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品經(jīng)消毒滅菌密封包裝，供一次性使用，重復(fù)使用的需經(jīng)特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均勻，有的表面經(jīng)特殊處理，細(xì)胞易于生長(zhǎng)。器械解剖刀、眼科剪和鑷（直頭和彎頭）、中號(hào)圓頭鑷、止血鉗等。雜用品金屬飯盒、試管架、各種規(guī)格膠塞、記號(hào)筆、搪瓷盤(pán)、吸頭（吸取液體的膠帽）、酒精燈、酒精、碘酒棉球瓶、火柴等。組織培養(yǎng)中使用最多的是吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及各種瓶塞。實(shí)驗(yàn)者手中應(yīng)有三套器材，瓶塞數(shù)要大于瓶數(shù)，才能保證實(shí)驗(yàn)中的循環(huán)使用。細(xì)胞培養(yǎng)用品的清洗與消毒滅菌⑴清洗常用玻璃器皿清洗?清洗要領(lǐng)浸泡初次使用的玻璃器皿呈堿性，表面常附有灰塵和一些對(duì)細(xì)胞有毒的物質(zhì)，如鋁和神等?？諝鉂穸雀邥r(shí)，玻璃器皿表面又易長(zhǎng)霉。使用前，新器皿浸泡在5%稀鹽酸中過(guò)夜，以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)并去除霉斑;然后經(jīng)簡(jiǎn)單刷洗，流水沖洗（逐片進(jìn)行），蒸餾水浸泡，干燥備用。新玻片處理后，短時(shí)間不用時(shí)，需將它投入95%的酒精中保存，以防玻片長(zhǎng)霉。培養(yǎng)后的玻璃器皿應(yīng)立即投入清水中浸泡，器皿中殘留的細(xì)胞、蛋白質(zhì)一旦十涸，即固著于玻璃表面，極難脫落。刷洗用過(guò)的玻璃器材經(jīng)自來(lái)水沖洗后，浸入水中煮沸，然后將適量洗滌劑（洗潔精或洗衣粉）投入沸水中繼續(xù)煮沸10分鐘，趁熱刷洗器皿內(nèi)外，刷洗后浸入清水中進(jìn)行沖洗。酸泡刷洗好的玻璃器材十燥后置清潔液中浸泡24小時(shí)，清潔液的強(qiáng)氧化作用可清除刷洗不掉的極微量雜質(zhì)。?清洗步驟玻璃器材煮沸10分鐘一刷洗一流水振蕩沖洗15-20遍一50°C烤十一清潔液浸泡24小時(shí)一流水振蕩后沖洗15-20遍一漓水一蒸餾水浸泡2次（每次24小時(shí)）一50C烤十，待包裝。?清洗注意事項(xiàng)和要求使用后的實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)立即投入清水中。浸泡、煮沸、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液體，不得有氣泡。刷洗、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗，不得殘留洗滌劑、清潔液。方法是：每瓶灌2/3容積的自來(lái)水，振蕩后倒掉，重復(fù)15-20次（尖滴管置量杯中沖洗）。煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗滌劑（直徑35厘米的鋁鍋，用洗衣粉10克左右）。若洗滌劑和實(shí)驗(yàn)器材同時(shí)從冷水煮至沸騰或使用過(guò)量洗劑，均易腐蝕玻璃表面，使玻璃堿化，pH值上升。軟毛刷的刷端已掉毛的應(yīng)該棄去，否則會(huì)損害玻璃。玻璃劃痕處易殘留洗滌劑，會(huì)改變培養(yǎng)液pH值和毒害細(xì)胞。清潔物品應(yīng)及時(shí)包裝消毒，應(yīng)注意妥善保存，防止落入灰塵、蟑螂、螞蟻等引起二次污染。使用后的膠塞與玻璃器材同時(shí)煮洗時(shí)，膠塞要放在煮鍋的底部。浸泡器材的蒸餾水容器要專(zhuān)用，并做好標(biāo)記，如“蒸餾水I盆”、“蒸餾水II盆”。器材清洗干燥后，在以后各步操作時(shí)，手指不可接觸器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套進(jìn)行操作，省時(shí)又保證清洗質(zhì)量。用超聲波儀清洗器材時(shí)，清洗要求同上。橡膠制品的清洗新購(gòu)置的橡膠制品（膠塞、膠管、橡皮乳頭）的洗滌方法如下：0.5摩爾/升NaOH煮沸15分鐘一流水沖洗一0.5摩爾/升HCl煮沸15分鐘一流水沖洗一自來(lái)水煮沸2次一蒸餾水煮沸20分鐘一50°C烤十備用。這樣處理可完全除凈膠塞上的硫磺等有毒物質(zhì)。用過(guò)的膠塞，其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因膠塞使用面常沾有洗滌劑，流水沖不凈，故膠塞洗刷的重點(diǎn)部位是膠塞使用面，用刷逐個(gè)刷洗。在使用過(guò)程中，膠塞不能與培養(yǎng)液接觸，以防未洗凈的膠塞污染培養(yǎng)液和細(xì)胞。G6除菌濾器的清洗新G6除菌濾器置玻璃洗液中浸泡24小時(shí)，流水緩慢沖洗，至pH值為5.5左右，然后用4倍的蒸餾水緩慢沖洗，再用重蒸餾水緩慢沖洗，烤干，包裝消毒備用。用過(guò)的G6除菌漏斗立即浸泡水中（注意：濾器千萬(wàn)不能十涸）過(guò)夜，流水緩慢沖洗24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，至濾面基本疏通時(shí)，50C烤十，濾器再置清潔液中浸泡24小時(shí)，或裝滿清潔液自然過(guò)濾。流水沖洗及其后的處理同新G6除菌濾器。正壓除菌濾器的清洗新的或使用后的正壓濾器經(jīng)稀洗滌劑刷洗一流水沖洗15分鐘一漓水一去離子水浸泡24小時(shí)一三蒸水浸泡24小時(shí)一十燥備用。塑料制品的清洗塑料制品質(zhì)地軟且耐腐蝕能力強(qiáng)，但不耐熱，易出現(xiàn)劃痕。其清洗程序?yàn)椋浩髅笥煤罅⒓从昧魉疀_洗一浸于自來(lái)水中過(guò)夜一用紗布、棉簽和50C稀洗液刷洗一流水沖洗（人工沖洗15—20遍）一晾十一浸于清潔液中15分鐘一流水沖洗一蒸餾水浸泡兩次（每次24小時(shí)）一晾十備用。清洗液的配制清潔液新配制的清潔液為棕紅色，遇有機(jī)溶劑或水分增多時(shí)變成綠色，表明失效。先在搪瓷盆中加入蒸餾水，加熱溶解重銘酸鉀，再將盆置流動(dòng)自來(lái)水中，待重銘酸鉀液冷卻后，緩慢加入濃硫酸，邊加邊用玻棒攪動(dòng)，以混合液溫度不過(guò)快上升和不出現(xiàn)重銘酸鉀結(jié)品為度。玻璃濾器洗液取10克硝酸鈉和28.6毫升濃硫酸，放入盛有470毫升蒸餾水的玻璃缸內(nèi)混勻備用。小鼠肝細(xì)胞的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾骄啃∈蟾渭?xì)胞分離和原代培養(yǎng)的方法。1材料與方法1.1動(dòng)物2?4周齡BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站動(dòng)物房提供）。1.2試劑D-hank's液；消化液I：含1g/L胰蛋白酶、10g/L聚乙烯毗咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP）及0.3g/LEDTA；消化液II：含2g/L膠原酶W及10g/LPVP；基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM,另含青霉素100u/ml、鏈霉素100pg/ml、50mmol/LHEPES、30g/L谷氨酰胺；小牛血清（BS,GIBCO公司提供）；培養(yǎng)基內(nèi)其他因子：胰島素5pg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5pg/ml、促甲狀腺素釋放因子10—6mol/L（Sigma公司產(chǎn)品）、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子20pg/ml、氫化可的松10—6mol/L。1.3鼠肝組織塊培養(yǎng)1） 取小鼠20只斷頭放血處死，置于75%酒精浸泡2-3分鐘，無(wú)菌分離肝組織后均在冰浴下操作。2） 肝組織用4°CD-hank's液（PBS）或不含BS的培養(yǎng)液洗凈血污，剝除包膜及纖維成分；3） 將肝組織切為約1mm3小塊，再用上述液體盡量洗去殘留血污，最后一次清洗后800r/min離心4min，棄上清，4）加入消化液1（5-6倍體積），37C孵育12min，再加入數(shù)滴血請(qǐng)終止消化。5）將消化好的肝組織塊用注射器栓輕輕研磨至糊狀，用雙層紗布去除組織屑，再經(jīng)200尼龍網(wǎng)過(guò)濾后1000r/min離心5分鐘去上清。再用無(wú)血清培養(yǎng)液洗三次去除胰酶，加入20%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸，收集肝細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)大于85%1.4鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)將活力在85%以上的肝細(xì)胞調(diào)整到5I。5/ml左右，轉(zhuǎn)移至25cm培養(yǎng)瓶中，37C、5%CO2條件下培養(yǎng)。24h首次換液，以后每?jī)商鞊Q液，并以20%胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。1.5肝細(xì)胞形態(tài)觀察及其功能測(cè)定原代培養(yǎng)前三天盡量不晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，以后每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每次換液前收集培養(yǎng)上