毛果楊nlp基因家族的生物信息學分析

毛果楊nlp基因家族的生物信息學分析

植物需要在整個生命周期中產生大量的氮素營養(yǎng)。硝酸鹽是土壤中存在的一種主要氮素形態(tài),在植物生長以及發(fā)育過程中發(fā)揮重要的生理以及營養(yǎng)作用［1］。植物中一些氮素吸收以及同化相關基因能夠受外界氮素濃度的影響在表達上發(fā)生變化,如銨轉運蛋白基因(AMT),硝酸鹽轉運蛋白基因(NRT),硝酸還原酶基因(NR)以及亞硝酸還原酶(NIR)［2～5］等。一些具有感知硝酸鹽信號能力的基因與轉錄因子在硝酸鹽吸收以及同化的過程中起著重要的調控作用［6］。NIN(noduleinception)基因在百脈根中被首次發(fā)現(xiàn),并確豆科植物根瘤形成依賴于該基因的存在,后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),在非豆科植物中也存在該類基因,推斷其可能參與到硝酸鹽的同化過程之中,并命名為NLP(NINlikeprotein)基因［8～9］。NLP基因家族成員都具有RWP-RK和PB1兩個典型的結構域,RWP-RK結構域具有與DNA結合的功能,PB1結構域具有與其他含有該結構域的基因形成二聚體的功能［8］。2008年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)NLP7是具有感應硝酸鹽信號的轉錄因子,在擬南芥中敲除NLP7后,擬南芥突變體nlp7與正常野生型相比顯示出明顯的缺氮狀態(tài)與抗旱能力,并且NRT2;1/2;2與NIR1/2基因表達量均顯著性下調;當在nlp7突變體中恢復NLP7表達之后,不僅恢復了這些基因的表達而且還恢復了突變體對硝酸鹽的吸收,由此證明NLP7基因具有參與感受硝酸鹽信號以及調節(jié)硝酸鹽吸收的功能［7］。2013年陸續(xù)兩篇文章對NLP基因家族成員的作用機理進行了系統(tǒng)的報道。Konishi等證明NLP基因的蛋白質N端能夠感受硝酸鹽信號,而后特異性的結合啟動子中具有NRE(nitrate-responsivecis-element)原件的基因,從而調節(jié)植物對硝酸鹽的吸收以及同化［11］。Marchive等對NLP7基因能影響的所有的代謝通路以及在硝酸鹽早期吸收以及利用上進行了細致的研究,結果表明NLP7基因不僅參與調控N代謝循環(huán),還對C代謝循環(huán)以及激素代謝有一定的調控功能［10］。楊屬(Populus)植物具有易繁殖,生長迅速等特點,并且諸多樹種已經建立了完善的遺傳轉化體系,成為木本植物研究的模式生物。自2006年毛果楊(Populustrichocarpa)基因組數(shù)據公布以來,其功能基因組學研究已逐步深入,僅就氮素吸收方面,毛果楊的AMT基因家族與NRT基因家族已經被詳細的分析［12～13］。本研究,以生物信息學方式對毛果楊的NLP基因家族成員進行確定,直系同源與旁系同源進化分析,基因結構分析,保守結構域分析,以及全組織表達模式分析,為進一步研究楊樹NLP基因功能以及在對硝酸鹽吸收與同化過程中的調控模式提供基礎。1材料和方法1.1nlp基因家族成員的確定［14～15］。將候選基因分別在SMART(SimpleModularArchitectureResearchTool)(http://smart.embl-heidelberg.de/)數(shù)據庫分析驗證RWP-RK與PB1基序的存在,將具有RWP-RK與PB1結構域的基因后確定為楊樹NLP基因家族成員。1.2楊樹nlp基因家族成員的蛋白質序列理化性質分析與細胞定位預測1.3旁系同源進化樹的構建［16］。將毛果楊NLP基因家族成員蛋白質序列通過ClustalW2軟件進行多重序列比對,利用軟件MEGA5采用鄰近法(N-J)法構建旁系同源進化樹,bootstrap值設置成1000次。1.4鉻定位分析［17］。1.5基因結構分析1.6楊潔篪遺傳因子的表現(xiàn)模式分析［18～19］。2結果與分析2.1rwp-rk的低親水性基因家族pb1經分析,最終確定了14個毛果楊NLP基因家族成員(表1)。這些毛果楊NLP基因家族成員均含有RWP-RK與PB1保守結構域。他們的蛋白質長度不等,最短的為519aa,最長的為1000aa。整個基因家族都具有低親水性的特點,GARVY值從-0.38~-0.646不等。等電點(pI)值最高達到7.86,最低的為5.25。所有家族成員均為細胞核定位。2.2毛果楊nlp基因家族成員構成為確定毛果楊NLP基因家族的本質特征,我們分別進行了直系同源以及旁系同源的進化分析。通過直系同源分析發(fā)現(xiàn),NLP基因家族共分成3個明顯的亞枝,分別將各亞枝命名為NLP1cluster,NLP2cluster和NLP3cluster(圖1)。在毛果楊中,NLP3cluster的成員最多,達19個,而NLP1cluster和NLP2cluster分別有3個和2個成員。與擬南芥相比毛果楊NLP基因家族成員的總數(shù)量是擬南芥的1.56倍,這個滿足Tuskan等提出的毛果楊基因家族成員的個數(shù)是擬南芥的相應同源基因數(shù)的1.4~1.6倍的推斷［17］。通過旁系同源進化分析我們共在毛果楊中找到6對同源基因對,每一個基因同源對的基因相互間同源性極高,這說明毛果楊NLP基因家族成員在楊樹進化過程中經歷了嚴格的進化選擇(圖2A)。2.3毛果楊基因組中的染色體同源基因為了明確毛果楊NLP基因家族成員間的進化關系,我們對所有成員進行了染色體定位分析。在14個成員中只有PtrNLP13不能定位在染色體上而是定位在scaffold片段外,其余的基因都分別定位在1、2、3、4、5、7、9、16和17號染色體中的染色體同源區(qū)域之內(圖3)。楊樹基因組在進化史上經歷了兩次染色體擴增事件,第一次來自擬南芥染色體加倍,第二次來自楊柳科染色體加倍［17］。在毛果楊基因組中存在著大量的染色體同源區(qū)域,在可以定位在毛果楊染色體中的NLP基因家族成員中除PtrNLP9丟失了同源基因外,其余的基因都能在相應的染色體同源區(qū)域中找到相應的同源基因?；蚣易宄蓡T的擴增來源于基因組的同源交換,染色體串聯(lián)復制等其他基因組進化的大事件。在毛果楊NLP基因家族成員的擴增中,主要是由于染色體的同源復制引起的。我們的分析發(fā)現(xiàn)4對基因(PtrNLP1/2,PtrNLP8/9,PtrNLP10/11和PtrNLP12/14)是由染色體片段復制事件引起的。而PtrNLP3/4/6/7四個基因有可能來源于同一個祖先基因,在毛果楊染色體進化史經歷了染色體片段復制后,又經歷了兩次串聯(lián)復制。該結果表明,毛果楊NLP基因家族成員的擴增來源于染色體的片段復制以及串聯(lián)復制事件。2.4nlp3clnuser成員間的基因結構為了進一步的了解毛果楊NLP基因家族成員間的特征,我們分析了毛果楊NLP基因家族成員的基因結構(圖2B)。NLP1/2cluster成員均含有5個外顯子,并且基因結構比較保守。但NLP3cluster成員含有2~7個外顯子,并且成員間基因結構有所差異。通過外顯子比對分析發(fā)現(xiàn)這種差異是由于外顯子的丟失以及內含子的插入或者缺失造成的。多重比對分析結果顯示,楊樹NLP成員間蛋白質序列比較保守,均含有RWP-RK與PB1保守區(qū)域,另外還存在4個未知功能的保守基序。但PtrNLP1C端大面積缺失,不存在這四個未知功能的保守基序(圖4)。2.5表達模式分析3毛果楊nlp基因家族分析NLP基因家族成員是一類轉錄因子,廣泛存在于豆科植物以及非豆科植物當中,它主要參與豆科植物根瘤的形成以及調控植物根部硝酸鹽的吸收［9］。擬南芥NLP基因家族成員的RWP-PK結構域的N端側翼序列具有感受硝酸鹽信號的功能,在感受到硝酸鹽信號后,NLP7蛋白質脫離翻譯后修飾狀態(tài)進入活躍狀態(tài),特異性的識別并結合具有NRE原件的基因的啟動子上,從而對提高可受硝酸鹽誘導的基因進行調控［10～11］。目前為止,植物中的NLP基因功能性研究較少,只有擬南芥NLP基因家族成員有較為詳細的功能性研究,而全基因組鑒定方面的報道更是少之又少。本文以毛果楊為模式植物,首次對林木類植物的NLP基因家族進行分析。通過對最新毛果楊蛋白質數(shù)據庫的搜索,我們共發(fā)現(xiàn)14個毛果楊NLP基因家族成員。毛果楊NLP基因家族成員的基因結構和結構域分布非常保守,都含有RWP-PK與PB1結構域,與其他非豆科植物NLP基因一樣,毛果楊NLP基因在N端多出兩段保守序列,這為豆科植物NLP基因與非豆科植物NLP基因功能上的差異性提供了分子證據［8］。直系同源進化分析結果表明,PtrNLP10/11與擬南芥AtNLP6/7被分配在同一個亞枝之中,并且PtrNLP11與AtNLP7具有相似的表達模式,因此我們推測PtrNLP11與AtNLP6/7具有相似的功能在楊樹根的硝酸鹽吸收以及同化過程中發(fā)揮重要的作用。芯片表達模式結果顯示