基于snp標(biāo)記的凹葉木蘭遺傳多樣性研究

基于snp標(biāo)記的凹葉木蘭遺傳多樣性研究

生物多樣性是世界上最寶貴的資源之一。這是人類社會(huì)生存和發(fā)展的基本食物、藥物和工業(yè)原因的主要來源，也是保護(hù)生態(tài)環(huán)境的重要基礎(chǔ)。物種的遺傳多樣性既是維持其繁殖活力和適應(yīng)環(huán)境變化的基礎(chǔ),又是其它一切多樣性的基礎(chǔ)和核心部分(Spiess,1989)。天然群體高水平遺傳多樣性的存在是群落穩(wěn)定的基礎(chǔ),而物種的受威脅和滅絕是以其遺傳多樣性的消失而產(chǎn)生的。如今,在珍稀瀕危物種的保護(hù)受到棲息地破壞與破碎化威脅的同時(shí),具有嚴(yán)格地理分布限制的特有種的保護(hù)成為生物學(xué)家們關(guān)心的一個(gè)重要問題(Ge等,2003)。因此,針對(duì)這些特有種開展遺傳多樣性研究成為當(dāng)務(wù)之急。凹葉木蘭(Magnoliasargentiana)是木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia)落葉喬木,其天然分布主要集中于四川中部的峨眉山和二郎山、南部的小涼山以及相鄰的云南東北部(中國植物志編輯委員會(huì),1996),常生長于海拔1400~2500m的闊葉林中(補(bǔ)舉才,1996),是我國特有的一種木蘭科植物。凹葉木蘭有重要的藥用與觀賞價(jià)值;同時(shí),由于木蘭科植物的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)具有許多原始特征,因此,凹葉木蘭也是研究被子植物系統(tǒng)發(fā)育和起源的珍貴材料(徐志豪等,2003)。目前凹葉木蘭自然居群分布范圍狹窄,居群數(shù)量少(羅紅梅,2007),根據(jù)IUCN(國際自然與自然資源保護(hù)聯(lián)合會(huì))公布的物種紅皮書名錄等級(jí)和標(biāo)準(zhǔn),凹葉木蘭被列入了中國物種紅皮書名錄,屬于易危物種;1987年該種被列為四川省三級(jí)保護(hù)植物。到目前為止,國內(nèi)外關(guān)于凹葉木蘭的研究較少,已有的研究主要包括羅紅梅(2007)基于蠟葉標(biāo)本進(jìn)行的葉片解剖結(jié)構(gòu)研究、莖解剖學(xué)研究及遺傳多樣性研究;王靜等(2009)在四川南部大風(fēng)頂?shù)貐^(qū)開展的種群生態(tài)學(xué)、保護(hù)現(xiàn)狀及針對(duì)性保護(hù)措施的研究。僅有的遺傳多樣性研究為利用隨機(jī)引物擴(kuò)增進(jìn)行的RAPD(RandomlyamplifiedpolymorphicDNA)分析(羅紅梅,2007)。但RAPD為顯性標(biāo)記,難以區(qū)別純合體和雜合體,有時(shí)帶型不穩(wěn)定,重復(fù)性差。隨著人類基因組測序工作的完成,作為第三代分子標(biāo)記技術(shù),單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)以其分布廣泛、數(shù)量眾多、易于批量檢測等優(yōu)點(diǎn)顯示出廣闊的應(yīng)用前景。目前,SNP標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因作圖、疾病相關(guān)性分析、群體遺傳學(xué)及藥物研究等領(lǐng)域(陳冬等,2008),應(yīng)用SNP標(biāo)記在草本植物中的研究也在大規(guī)模的展開(Rafalski,2002)。近年來,SNP研究開始應(yīng)用到林木這類重要的多年生木本植物中,并已對(duì)松(Pinusspp.)、楊(Populusspp.)、黃杉(Pseudotsugaspp.)、云杉(Piceaspp.)等4屬7個(gè)樹種的核苷酸多樣性特征進(jìn)行了初步解析(褚延廣等,2008)。而利用SNP對(duì)凹葉木蘭進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究尚未見報(bào)道。本研究采用以PCR和測序?yàn)榛A(chǔ)的SNP分子標(biāo)記手段,對(duì)凹葉木蘭的遺傳多樣性進(jìn)行了初步研究,為針對(duì)該珍稀、易危植物制定保護(hù)措施提供一些基本信息。研究過程和結(jié)果可為日后進(jìn)一步開展遺傳多樣性研究提供參考。1材料和方法1.1樣品的采集和保存研究所用的29個(gè)凹葉木蘭個(gè)體的嫩芽樣品(表1)于2007年分別隨機(jī)采自四川雷波縣麻咪澤省級(jí)自然保護(hù)區(qū)(22個(gè))和美姑縣美姑大風(fēng)頂國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(7個(gè))。樣品采集后即置于有硅膠的密封袋中保存,防止DNA降解。引物篩選所用正對(duì)照楊樹葉片采自四川大學(xué)望江校園內(nèi)。1.2方法1.2.1genusraptegenetogthna提取基因組DNA采用大連寶生(TaKaRa)公司的GenomeUniversalDNA提取試劑盒分批提取。對(duì)所提取的基因組DNA標(biāo)號(hào),貯存于-20℃冰箱中備用。1.2.2共有序列的提取美國加州大學(xué)戴維斯分校(UniversityofCalifornia,Davis)的MingchengLuo實(shí)驗(yàn)室從NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,USA)的毛果楊(Populustrichocarpa)uniGene數(shù)據(jù)庫中下載了毛果楊的單基因序列,并將其與擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因序列對(duì)比,發(fā)現(xiàn)其中一段共有序列。由于毛果楊(楊柳科)與擬南芥(十字花科)為系統(tǒng)位置跨度很大的兩種植物,該段序列共有的現(xiàn)象說明了此段序列具有高度的保守性,故推斷在凹葉木蘭的基因序列中也應(yīng)存在該段序列。據(jù)此,MingchengLuo實(shí)驗(yàn)室為我們的這一研究設(shè)計(jì)出225對(duì)引物。在本研究中,我們隨機(jī)選取了10對(duì)引物(表2),并從已提取的凹葉木蘭樣品基因組中隨機(jī)選擇一個(gè)作為模板、以楊樹模板為正對(duì)照,對(duì)10對(duì)引物進(jìn)行復(fù)選,最終選定了條帶清晰、無雜帶的356號(hào)引物(圖1)用于本實(shí)驗(yàn)。20μL引物篩選PCR擴(kuò)增體系為:10×PCR緩沖液2μL(TIANGEN公司),模板基因組DNA2μL,dNTPs0.2μL,MgCl21.2μL(TIANGEN公司),雙向引物各0.2μL,Taq酶0.2μL(TIAN-GEN公司),ddH2O14μL。PCR反應(yīng)在ALS1296PCR儀(Bio-Rad)上完成。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4min;94℃變性15s,50℃退火15s,72℃延伸45s,循環(huán)40次。1.2.3pcr擴(kuò)增條件引物選定后,以所提取的凹葉木蘭基因組DNA為模板,用選定的356號(hào)引物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。由于要對(duì)所擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行測序,為避免Taq酶引起的堿基突變而造成測序結(jié)果不準(zhǔn)確,本實(shí)驗(yàn)選用體積比為4∶1的Taq酶與Pfu高保真酶混合酶。40μLPCR反應(yīng)體系包括:10×PCR緩沖液4μL(TIANGEN公司),基因組DNA模板4μL,dNTPs0.4μL,MgCl22.4μL(TIANGEN公司),雙向引物各0.4μL,Taq酶混Pfu酶0.4μL(TIANGEN公司),ddH2O28μL。PCR反應(yīng)在ALS1296PCR儀(BioRad)上完成。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性4min;94℃變性15s,50℃15s,72℃延伸60s,循環(huán)40次。PCR擴(kuò)增后,采用Omega膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收,進(jìn)而進(jìn)行之后的連接、轉(zhuǎn)化等步驟;對(duì)暫時(shí)不用回收的產(chǎn)物進(jìn)行編號(hào)并貯存于-20℃冰箱。1.2.4pcr檢測dna由于本實(shí)驗(yàn)中的PCR產(chǎn)物濃度達(dá)不到直接測序的要求,故采用傳統(tǒng)的連接、轉(zhuǎn)化、涂板、檢測、再測序的方法。具體過程為:將回收的目的片段連接到PMD19-T載體中(連接體系見表3),再將連接了目的片段的載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),置于SOC(SuperOptimalbrothwithCatabolicrepressor)培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)1h;將菌液均勻地涂在加入氨芐(Amp)的LB(Lysogenybroth)固體培養(yǎng)基上,于37℃條件下培養(yǎng)12h;對(duì)生長狀況良好的單菌落進(jìn)行挑菌,最后進(jìn)行菌落PCR檢測,程序同20μLPCR反應(yīng)體系,模板為槍頭挑取的微量菌體,ddH2O的加入量為16μL,其余成分不變。選擇菌落檢測為陽性的菌液送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。1.2.5在線序列比對(duì)測序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫中在線序列比對(duì)軟件BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)以及EBI(EuropeanBioinformaticsInstitute)網(wǎng)頁中在線序列比對(duì)軟件Clustalw2進(jìn)行樣本序列與引物所對(duì)毛果楊序列的同源性比對(duì)以及樣本序列間相似性比對(duì),找出SNP位點(diǎn)。利用DnaSP軟件計(jì)算樣本核苷酸多樣性指數(shù)π,該指數(shù)越高則遺傳多樣性越高。2結(jié)果與分析2.1相似比對(duì)檢驗(yàn)對(duì)29個(gè)樣本進(jìn)行測序,最終得到4條有效序列(表1)。表1測序結(jié)果顯示,所測片段長度均為512bp,與實(shí)驗(yàn)中根據(jù)毛果楊序列所設(shè)計(jì)的引物所對(duì)原始片段長度(510bp)相符。BLAST軟件進(jìn)行相似比對(duì)結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)所得凹葉木蘭序列的確與毛果楊序列相似,相似區(qū)域達(dá)36%。利用Clustalw2在線比對(duì)軟件,將引物所對(duì)毛果楊序列片段與測序序列一一進(jìn)行比對(duì),相似度分別為30%、29%、30%和29%(表4)。4個(gè)樣品的序列與毛果楊序列的相似性一致。2.2snp位點(diǎn)特征運(yùn)用Clustalw2在線比對(duì)軟件,對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行樣本間縱向比較。結(jié)果顯示(表4),樣本間同源性很高,相似度均在97%以上。1號(hào)樣本與2、3、4號(hào)樣本間的SNP位點(diǎn)分別為:11個(gè)、5個(gè)和7個(gè),即在512bp長度的序列上,SNP位點(diǎn)平均至少達(dá)7個(gè),即平均每73bp長度的片段上就存在一個(gè)SNP位點(diǎn)。利用DnaSP軟件計(jì)算得出凹葉木蘭樣本核苷酸多樣性指數(shù)π為0.0178。3結(jié)論和討論3.1pcr假陽性檢測對(duì)29個(gè)樣本的測序結(jié)果進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn),除4個(gè)序列結(jié)果正常外,其余序列均為未插入目的片段的空載體序列。未插入目的片段的可能原因是在涂板過程中有部分沒有連接入載體的目的片段殘留在平板上,這些片段粘在細(xì)菌表面隨細(xì)菌一起培養(yǎng),而在挑單克隆進(jìn)行菌落PCR時(shí),因模板中含有這些片段,因此出現(xiàn)了PCR假陽性的結(jié)果。為避免以上情況出現(xiàn),在測序之前除進(jìn)行菌落PCR檢測外,還應(yīng)對(duì)菌液提質(zhì)粒,以質(zhì)粒為模板再進(jìn)行PCR,同時(shí)對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測。本實(shí)驗(yàn)由于時(shí)間限制,只進(jìn)行了菌落PCR檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果有局限性。但僅有的4個(gè)數(shù)據(jù)仍在一定程度上反應(yīng)出凹葉木蘭遺傳多樣性水平。3.2毛果楊同源性分析由于NCBI數(shù)據(jù)庫中木蘭科植物的數(shù)據(jù)非常少,在將得到的序列放在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)時(shí),僅找到3條毛果楊的序列與所得的序列相近,同源性均為36%。這一方面驗(yàn)證了所擴(kuò)增序列的正確性,另一方面說明該段序列在植物進(jìn)化中較為保守,在楊樹、擬南芥和凹葉木蘭中都存在同源的部分,但在保守的同時(shí)又存在差異,說明了該段序列在不同的植物進(jìn)化中又有一定的變異。因此,在日后開展凹葉木蘭遺傳多樣性的研究時(shí),仍可采用該段序列。3.3基因流對(duì)凹葉植物遺傳多樣性的影響本研究運(yùn)用在PCR和測序基礎(chǔ)上的SNP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)凹葉木蘭的遺傳多樣性進(jìn)行了初步分析。在512bp長度的序列上,SNP位點(diǎn)平均達(dá)7個(gè)以上,即平均每73bp長度的片段上就存在一個(gè)SNP位點(diǎn),核苷酸多樣性指數(shù)π約為0.0178。Tenaillon等(2001)對(duì)玉米1號(hào)染色體的21個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)平均104bp中有一個(gè)SNP,核苷酸多樣性指數(shù)π為0.0063~0.0096;對(duì)毛果楊(P.trichocarpa)基因組序列的分析共發(fā)現(xiàn)1241251個(gè)SNP位點(diǎn)(包括插入和缺失),平均約每1kbDNA存在2.6個(gè)SNP,核苷酸多樣性指數(shù)π為0.016(Tuskan等,2006);擬南芥(A.thaliana)核苷酸多樣性指數(shù)π為0.007(Nordborg等,2005);水稻(Oryzasativa)核苷酸多樣性指數(shù)π為0.0035(Caicedo等,2007);挪威云杉(Piceaabies)核苷酸多樣性指數(shù)π為0.00399(Heuertz等,2006)。綜上所述認(rèn)為凹葉木蘭樣品具有較高的遺傳多樣性。凹葉木蘭自然分布范圍狹窄、居群數(shù)量少?；谥参锿っ傅难芯?Karron(1991)提出,受地理?xiàng)l件限制的特有植物通常由于基因漂移與受限的基因流而具有較低的遺傳多樣性,以此推論,凹葉木蘭的遺傳多樣性應(yīng)該較低。但本研究的結(jié)果揭示出凹葉木蘭較高的遺傳多樣性,與Karron(1991)的結(jié)論不同,這部分說明居群分布范圍不能直接體現(xiàn)凹葉木蘭遺傳多樣性的高低,同時(shí)也說明基于同工酶研究的結(jié)論并不一定具有普遍意義。羅紅梅(2007)運(yùn)用RAPD對(duì)凹葉木蘭進(jìn)行的遺傳多樣性研究結(jié)果也揭示出該物種具有較高的遺傳多樣性,本研究支持了這種結(jié)果。羅紅梅(2007)研究結(jié)果還表明,凹葉木蘭個(gè)體間的遺傳距離與這些個(gè)體所屬居群間的地理分布間隔呈正相關(guān),即兩居群間隔距離越大,遺傳差異越大。與凹葉木蘭類似,不少喬木樹種都具有種群分布極為有限但遺傳多樣性較高的特征(Bartish等,1999)。根據(jù)Maguire等(1997)的研究,對(duì)于具有高遺傳多樣性、低種群數(shù)量特征的稀有植物,形成該特征具有一系列可能因素:(1)在某些特殊情況下,種群數(shù)量明顯下降,而其遺傳多樣性沒有經(jīng)過足夠長時(shí)間降低至與自然狀態(tài)下具有該數(shù)量大小的種群所應(yīng)具有的遺傳多樣性高低相符的狀態(tài);(2)基因系統(tǒng)對(duì)于小種群條件的適應(yīng);(3)曾經(jīng)連續(xù)的基因系統(tǒng)受到破壞,如人類干擾;(4)鳥類傳粉與高異交率結(jié)合而形成的較高基因流。若基因流是相鄰種群遺傳結(jié)構(gòu)的首要因素,通常地理位置相近的種群間的遺傳相似性比地理位置間隔遠(yuǎn)的種群間高(Ge等,2003)。結(jié)合羅紅梅(2007)和本研究結(jié)果,我們推測,基因流是決定凹葉木蘭種群遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素。大量同工酶研究以及日益劇增的葉綠體DNA(cpDNA)與線粒體DNA(mtDNA)研究結(jié)果表明,受到“避難所”保護(hù)的植物類群其后代通常具有較高的遺傳多樣性(Lewis等,1995)。據(jù)考證,中生代白堊紀(jì)地質(zhì)運(yùn)動(dòng)使得四川盆地四周隆起,大、小涼山即在此時(shí)形成,環(huán)境的變遷促使古生物物種得以繁榮發(fā)展(劉金波等,2006)。本研究樣品采樣地雷波麻咪澤自然保護(hù)區(qū),位于四川盆地西南邊緣,涼山山系主峰黃毛埂東坡,金沙江下游北岸,緊鄰另一采樣地美姑大風(fēng)頂國家自然保護(hù)區(qū)。兩區(qū)地處小涼山,屬亞熱帶濕潤氣候類型。由于所屬地理位置的特殊性,采樣地區(qū)以