轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)

食品生物技術(shù)與食品安全檢測目錄一、轉(zhuǎn)基因食品的檢測方法目前已有的轉(zhuǎn)基因檢測方法主要有兩大類：一類是蛋白質(zhì)水平的檢測；另一類是核酸水平的檢測。主要方法免疫學(xué)方法核酸探針法分子標(biāo)記法蛋白質(zhì)水平核酸水平檢測目標(biāo)：DNA,RNA和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)DNARNA血清學(xué)方法PCR及核酸雜交方法（一）、蛋白質(zhì)水平檢測方法免疫分析技術(shù)是通過抗原抗體之間的特異反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：具有高度特異性，即使在待測樣品中有干擾性化合物存在，也能準(zhǔn)確識別抗原性物質(zhì)。免疫學(xué)分析技術(shù)蛋白質(zhì)印跡法酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試紙條法蛋白質(zhì)印跡法將電泳較高的分離能力、抗體的特異性和顯色酶反應(yīng)的靈敏性結(jié)合起來。是檢測復(fù)雜混合物中特異蛋白質(zhì)的最有力的工具之一。可確定一個樣品中是否含有低于或超過預(yù)定限值水平的目的蛋白質(zhì)，特別是不可溶蛋白質(zhì)的分析。此方法實(shí)際可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因RoundupReady大豆原料和大豆蛋白質(zhì)產(chǎn)品的檢測。酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測是將抗原和抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物的高效催化作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用于底物后的顯色反應(yīng)，當(dāng)抗原與抗體結(jié)合時，借助于比色或熒光反應(yīng)鑒定轉(zhuǎn)基因食品。優(yōu)點(diǎn)：提高了檢測靈敏度，能產(chǎn)生有顏色的底物，通過儀器或肉眼識別，具有高度選擇性、靈敏性和商業(yè)可利用性。缺點(diǎn)：復(fù)雜的基質(zhì)對它的準(zhǔn)確性和精度性有干擾，并且外源基因表達(dá)蛋白質(zhì)含量低或熱處理變性時，此免疫方法的檢測能力下降。試紙條法將特異性抗體交聯(lián)到試紙上，當(dāng)紙上抗體與特異抗原（待測抗原）結(jié)合后，再與帶有標(biāo)記物的特異抗體進(jìn)行反應(yīng)，即可在試紙上形成帶有顏色的三明治結(jié)構(gòu)。此法不需要特殊儀器，方便攜帶，適用于現(xiàn)場檢測或初篩。（二）、核酸水平檢測方法DNA檢測法的基礎(chǔ)原理是互補(bǔ)的DNA雙螺旋的兩條鏈的序列特異性雜交。DNA檢測法PCR技術(shù)PCR-ELISA巢式定性PCR電化學(xué)發(fā)光PCR復(fù)合擴(kuò)增PCRPCR技術(shù)PCR技術(shù)（聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)）是指模擬體內(nèi)DNA復(fù)制方式在體外選擇性擴(kuò)增DNA某個特殊區(qū)域的技術(shù)。具有短時間內(nèi)準(zhǔn)確大量復(fù)制目的順序，具有靈敏度較高、特異性強(qiáng)、可準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)，是目前轉(zhuǎn)基因食品檢測中最為成熟的方法?；疽兀耗０澹铩⒑铣蒁NA的原料即dNTP和DNA聚合酶。關(guān)鍵步驟：DNA抽提與純化。PCR既可做定性又可做定量分析。1、定性PCR技術(shù)其原理：轉(zhuǎn)基因食品重組DNA的基本結(jié)構(gòu)包括啟動子、目的基因、終止子和標(biāo)記基因，其中啟動子和終止子為表達(dá)目的基因所必需的。而現(xiàn)有的商品化轉(zhuǎn)基因食品中絕大多數(shù)含花椰菜花葉病毒啟動子CaMV35S、根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)錄終止子NOS及抗生素抗性基因NFI’II。人們可通過擴(kuò)增這些特殊的啟動子和終止子序列，鑒定食品中有無轉(zhuǎn)基因成分。目前為止，利用定性PCR檢測技術(shù)可檢測如大豆，玉米、番茄、油菜等多種轉(zhuǎn)基因作物。2、定量PCR技術(shù)在定性篩選PCR方法的基礎(chǔ)上，引入內(nèi)部參照反應(yīng)以消除檢測時的干擾，并與已知含量的系列GMO標(biāo)準(zhǔn)樣品的PCR結(jié)果進(jìn)行比較，從而可以半定量地檢測待測樣品中的GMO含量。（1）半定量PCR通過同時擴(kuò)增待測樣品和一系列標(biāo)準(zhǔn)樣品中共有核酸成分，由標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線來判斷待測樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量。2、定量PCR技術(shù)（2）定量競爭性PCR其基本原理：采用構(gòu)建的競爭DNA與樣品DNA相互競爭相同底物和引物，并根據(jù)電泳結(jié)果以競爭模板的稀釋度和結(jié)果做標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到可靠的定量分析結(jié)果。特點(diǎn)：含有內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)子，可降低實(shí)驗(yàn)室之間的測量誤差。因此，構(gòu)建理想的內(nèi)標(biāo)是競爭性定量PCR法的關(guān)鍵。2、定量PCR技術(shù)（3）實(shí)時熒光定量PCR在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，添加一條標(biāo)記了兩個熒光基團(tuán)的探針，一個標(biāo)記在探針的5’端，另一個標(biāo)記在探針的3’端。優(yōu)點(diǎn)：采用了獨(dú)特的全封閉反應(yīng)，減少了污染，具有高度的靈敏性。缺點(diǎn)：熒光標(biāo)記探針會在一些食物基質(zhì)中水解；且操作儀器較貴。應(yīng)用：日本、韓國和美國等采用這一方法分析了5個轉(zhuǎn)基因玉米品種和1種轉(zhuǎn)基因大豆。它是目前最具應(yīng)用前景的一種方法。PCR-ELISA將PCR技術(shù)與ELISA相結(jié)合的方法。既適合快速的定性篩選又可進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。巢式定性PCR（nested-PCR）由兩對巢式引物和兩輪PCR擴(kuò)增所組成。此法極大地提高檢測的靈敏度和特異性，避免伴有假陽性或假陰性現(xiàn)象。此法在轉(zhuǎn)基因成分很少時也能檢測出來。復(fù)合擴(kuò)增PCR（multiplexPCR）一種高效的針對多個靶位點(diǎn)進(jìn)行同時檢測的技術(shù)。具體是在同一反應(yīng)管中放入一對以上引物，在同一反應(yīng)中同時擴(kuò)增兩個或多個目標(biāo)基因序列，可以同時針對幾個靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR技術(shù)檢測。電化學(xué)發(fā)光PCR（ECL-PCR）新型的基因檢測技術(shù)，它將電化學(xué)發(fā)光的高靈敏度與傳統(tǒng)分子生物方法的穩(wěn)定性結(jié)合于一體。具有無放射性危害、高靈敏度、操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。其有望成為一種定量檢測轉(zhuǎn)基因植物的方法.（三）、基因芯片基因芯片又稱DNA微陣列，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律的排列固定于支持物上形成的DNA分子陣列。可以鑒定和分析