慢病毒介導(dǎo)的sirna沉默mrp4基因?qū)562adr細(xì)胞的敏感性

慢病毒介導(dǎo)的sirna沉默mrp4基因?qū)562adr細(xì)胞的敏感性

急性髓內(nèi)血液系統(tǒng)（pml）是一種具有骨髓和/或骨髓骨髓發(fā)育和骨髓擴(kuò)張的惡性骨腫瘤。在過去的30年里，聯(lián)合應(yīng)用抗凝劑和環(huán)丙烯酸酯對(duì)抗劑的聯(lián)合化療后，給予了良好的效果，但患者的一般預(yù)后仍然較差。主要原因是多藥物多葉銀杏葉（mdr）的出現(xiàn)。因此，決定多藥物多葉銀杏葉是治療aml的關(guān)鍵。多藥物類抗生素物質(zhì)的多藥物類抗生素物質(zhì)是轉(zhuǎn)移到艦隊(duì)的藥物（多劑環(huán)磷酰亞胺c）的藥物。這些藥物通過結(jié)合鹽業(yè)以泵送細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)泵送水分。過度的表達(dá)通常會(huì)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。mrp4是更新細(xì)胞c的超級(jí)家族成員。1999年，他的基因首次發(fā)現(xiàn)。mrp4的特點(diǎn)是，轉(zhuǎn)移的基質(zhì)是廣泛的，包括防感染藥物、抗生素、心血管藥物和細(xì)胞毒素。作為一種新的治療方法，它可以適應(yīng)不同細(xì)胞的復(fù)雜和多樣的病理生理過程，調(diào)整不同細(xì)胞的預(yù)測(cè)和信號(hào)轉(zhuǎn)移。根據(jù)研究，mrp4不是mrp家族的其他成員?？鼓懠t素細(xì)胞瘤的表現(xiàn)為顯著增加，這與抗膽紅素細(xì)胞瘤的副作用的預(yù)后密切相關(guān)。同時(shí)，在急性血液中，mrp4可以用作早期幼兒園血管的表面特征。此外，在一些研究中，6-iii-ii類細(xì)胞株的mrp4比galm-p的細(xì)胞株高4倍。然而，mrp4在aml中的重要性和多藥物類抗生素在藥物治療中的作用尚不清楚。在初始實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)k562/adr細(xì)胞株的mrp4顯著增加（圖1）。因此，我們使用ra干擾法穩(wěn)定k562/adr細(xì)胞株的mrp4，并研究是否可以逆轉(zhuǎn)k562/adr對(duì)氨基c的耐藥性并增加對(duì)黃疸的敏感性。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)為外源或內(nèi)源性雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的mRNA特異性降解,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象,其中起作用的是小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA).這一過程可運(yùn)用編碼短發(fā)卡RNA(shorthairpin-containingRNA,shRNA)序列的雙鏈DNA載體或包含編碼shRNA序列的雙鏈DNA病毒載體來(lái)完成;而后者因其攜帶的siRNA可以長(zhǎng)期、穩(wěn)定的表達(dá)進(jìn)而在體內(nèi)發(fā)揮較強(qiáng)的基因沉默效應(yīng)而具有優(yōu)勢(shì);本實(shí)驗(yàn)選用慢病毒作為載體.研究已經(jīng)證實(shí),RNAi是克服ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的耐藥的有效手段,并且可能在未來(lái)白血病的治療中發(fā)揮潛在的作用.本研究結(jié)果顯示,MRP4可能參與了耐阿霉素的急性髓系白血病細(xì)胞株的耐藥機(jī)制.此外,針對(duì)MRP4基因的慢病毒載體為siRNA成功轉(zhuǎn)入K562/ADR細(xì)胞株提供了可行性,聯(lián)合阿霉素后可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡,這為今后AML的基因治療奠定了基礎(chǔ).1lv-shrna-mrp4基因表達(dá)分析(ⅰ)藥物與細(xì)胞培養(yǎng).阿霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,以蒸餾水稀釋后過濾、分裝,儲(chǔ)存于–30℃冰箱,實(shí)驗(yàn)前稀釋成所需濃度.慢性粒細(xì)胞白血病急紅變細(xì)胞株(K562/ADR)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所,K562細(xì)胞株由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供.細(xì)胞完全培養(yǎng)基為:RPMI1640+10%胎牛血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1%抗體(100IU/mL青霉素,100μg/mL鏈霉素),在37℃,含5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).K562/ADR的IC50值為(60.33±10.68)μg/mL.(ⅲ)慢病毒介導(dǎo)的shRNA(lv-shRNA)的構(gòu)建pGCL-GFP慢病毒載體包含攜帶GFP的CMV報(bào)道基因及上游的U6啟動(dòng)子.合成含shRNA序列的雙鏈DNA寡核苷酸(表1),其兩端含酶切位點(diǎn)黏端,直接連入酶切后的慢病毒載體上.將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,對(duì)長(zhǎng)出的克隆先進(jìn)行PCR鑒定,在進(jìn)行測(cè)序比對(duì)后,鑒定陽(yáng)性克隆即為構(gòu)建成功的MRP4基因RNAi慢病毒載體,即lv-shRNA-MRP4;陰性對(duì)照為lv-shRNA-NC.隨后應(yīng)用realtimePCR檢測(cè)5種lv-shRNA-MRP4沉默MRP4基因的效率.(ⅳ)慢病毒的包裝與濃縮.制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒,按美國(guó)Invitrogen公司Lipofectamine2000使用說明書進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,再培養(yǎng)48h后收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液,對(duì)其濃縮以后得到高滴度的慢病毒濃縮液,在293T細(xì)胞中測(cè)定并標(biāo)定病毒滴度.本實(shí)驗(yàn)的病毒滴度為2×109TU/mL.(ⅴ)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效率.為了解lv-shRNA-MRP4及l(fā)v-shRNA-NC感染K562/ADR細(xì)胞效率,用日本Olympus熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況,轉(zhuǎn)染5d后收集K562/ADR細(xì)胞并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).(ⅵ)Real-timePCR檢測(cè)mRNA表達(dá).實(shí)驗(yàn)分為3組,即對(duì)照組(controlcells,CON)、陰性對(duì)照組(lvshRNA-NC,NC)、實(shí)驗(yàn)組(lv-shRNA-MRP4,knockdowncells,KD).感染5d后,收集K562/ADR細(xì)胞,采用美國(guó)Invitrogen公司TRIzol一步法抽提總RNA,按美國(guó)Promega北京分公司逆轉(zhuǎn)錄盒進(jìn)行操作.Actin為內(nèi)參,設(shè)定程序?yàn)閮刹椒╮eal-timePCR:預(yù)變性95℃,15s;95℃,5s;退火延伸60℃,30s,45個(gè)循環(huán).上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.real-timePCR數(shù)值分析采用2-??Ct分析法.引物由上海吉?jiǎng)P基因公司合成,MRP4上游引物:5uf0a2-GTTCTTCTGGTGGCTCAATCC-3uf0a2,下游引物5uf0a2-GGCTTCTGTGCGTCATTCTC-3uf0a2,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度168bp;actin上游引物5uf0a2-GGCGGCACCACCAT-GTACCCT-3uf0a2,下游引物5uf0a2-AGGGGCCGGACTC-GTCATACT-3uf0a2,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度202bp.(ⅶ)Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá).感染7d后收集細(xì)胞,并用PBS液洗滌2次;加入適量裂解緩沖液(100mmol/LTris-HCl,pH6.8,4%SDS,2%巰基乙醇,20%甘油);超聲破碎儀破碎細(xì)胞;離心、取上清,用上海捷倍思基因公司BCA蛋白測(cè)試盒測(cè)蛋白濃度,將終濃度調(diào)整為2μg/μL;制備上樣緩沖液(100mmol/LTris-HCl,pH6.8,4%SDS,20%甘油,2%巰基乙醇,0.4%溴酚蘭);制備8%SDS,加樣電泳、轉(zhuǎn)膜;用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉PVDF膜,首先孵育美國(guó)SantaCruz及Abcam公司小鼠抗人GAPDH及MRP4一抗,隨后孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的美國(guó)Santacruz公司羊抗小鼠二抗.采用英國(guó)Amersham公司ECL+plusTMWesternblot試劑盒進(jìn)行顯色,在暗房中進(jìn)行并獲得顯示條帶的膠片.(ⅷ)MTS法測(cè)定細(xì)胞增殖活性.使用美國(guó)Promega北京分公司MTS試劑盒測(cè)定K562/ADR細(xì)胞增殖活性.實(shí)驗(yàn)分為6組:CON,NC,KD及CON+ADR,NC+ADR,KD+ADR(加阿霉素組,藥物終濃度為IC50值60μg/mL).將2×104細(xì)胞/孔接種于96孔板每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔;置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);檢測(cè)時(shí)間為加藥后24和48h;培養(yǎng)終止前3h加入20μLMTS試劑;酶標(biāo)儀490nm檢測(cè)A值.(ⅸ)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡.應(yīng)用美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分比,采用美國(guó)eBioscience公司AnnexinV-FITC/PI凋亡雙染試劑盒將約1×105細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)皿中,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔;實(shí)驗(yàn)分組同MTS法;PBS液洗滌細(xì)胞后重懸使細(xì)胞懸液及AnnexinV/PI染液共100μL,室溫孵育15min;補(bǔ)足細(xì)胞染色緩沖液至400μL,上機(jī)檢測(cè).(ⅹ)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理;數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;多個(gè)樣本之間比較采用ANOVA分析;P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.2結(jié)果2.1k562/adr細(xì)胞在k562/adr細(xì)胞感染后培養(yǎng)方面的表現(xiàn)Lv-shRNA感染K562/ADR細(xì)胞的效率均達(dá)到80%以上(圖2).K562/ADR細(xì)胞感染后分別進(jìn)行real-timePCR及Westernblot檢測(cè),同時(shí)應(yīng)用MTS法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡.2.2k1k5基因mrp4基因回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)我們構(gòu)建了5個(gè)針對(duì)靶基因MRP4的慢病毒載體lv-shRNA1-MRP4～lv-shRNA5-MRP4(KD1～KD5),隨后用real-timePCR檢測(cè)KD1～KD5基因沉默效應(yīng).收獲感染NC及KD1～KD55d后的RKO細(xì)胞,提取RNA并進(jìn)行real-timePCR.如圖3所示,KD1～KD5靶點(diǎn)MRP4mRNA的表達(dá)均較CON及NC組明顯受抑(P<0.05),而其中NC組與CON組MRP4mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05).但KD1靶點(diǎn)對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)MRP4基因的表達(dá)抑制作用更強(qiáng),約為80%.因此我們將KD1作為后續(xù)K562/ADR細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的靶點(diǎn).2.3k562/adr細(xì)胞對(duì)mrp4基因表達(dá)的影響為了檢測(cè)KD1對(duì)K562/ADR細(xì)胞的影響,收取感染NC及KD1后5,7及8d的K562/ADR細(xì)胞,應(yīng)用real-timePCR及Westernblot檢測(cè)MRP4mRNA及蛋白表達(dá).如圖4(a)所示,KD1組對(duì)MRP4基因mRNA的表達(dá)有顯著抑制效果,KD1組、NC組及CON組MRP4基因mRNA的表達(dá)分別為0.115±0.005,1.001±0.051,0.758±0.108(P<0.05).KD1抑制K562/ADR細(xì)胞MRP4基因mRNA表達(dá)的同時(shí),從Westernblot結(jié)果可以看出(圖4(b)),它還在感染7和8d后均抑制了MRP4蛋白的表達(dá).2.4阿霉素對(duì)k562/adr細(xì)胞增殖的影響將感染NC及KD1的K562/ADR細(xì)胞加入終濃度為60μg/mL的阿霉素,分別培養(yǎng)24,48h后收獲細(xì)胞,MTS法檢測(cè)細(xì)胞活性.結(jié)果顯示(圖5),lv-shRNA1-MRP4聯(lián)合阿霉素(KD1+ADR)較其他組K562/ADR細(xì)胞的增殖受抑(P<0.05);加入阿霉素48h后,相對(duì)于CON組,CON+ADR組、NC+ADR組、KD1+ADR組K562/ADR細(xì)胞存活率分別為79.1%,76.3%,47.7%(P<0.05);不加阿霉素,CON組、NC組及KD1組K562/ADR細(xì)胞存活無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).2.5小鼠血清lv-shrna1-mrp4k562/adr1的凋亡檢測(cè)為了研究沉默MRP4基因后能否增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的K562/ADR細(xì)胞的凋亡,NC及KD1感染K562/ADR細(xì)胞后加入終濃度為60μg/mL的阿霉素,培養(yǎng)24h后收獲細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè).凋亡結(jié)果顯示(圖6),lv-shRNA1-MRP4聯(lián)合阿霉素(KD1+ADR)較其他組K562/ADR細(xì)胞凋亡增加(P<0.05);CON+ADR組、NC+ADR組、KD1+ADR組細(xì)胞凋亡百分比為11.37%,10.74%,17.9%,均較未加藥的CON組、NC組及KD1組(細(xì)胞凋亡百分比分別為8.03%,7.94%,8.23%)凋亡增加(P<0.05);而CON組、NC組及KD1組細(xì)胞凋亡百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).3mrp4在耐藥阿霉素耐藥中的作用白血病是血液系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率最高的疾病,近年來(lái)盡管化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用已取得了可喜的療效,但仍有一部分患者復(fù)發(fā)或伴隨較差的預(yù)后,其主要原因是白血病細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生.如何提高白血病細(xì)胞對(duì)化療的敏感性是白血病治療的關(guān)鍵所在.阿霉素是治療AML的常規(guī)蒽環(huán)類抗癌抗生素,屬于拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑,可通過抑制雙鏈DNA的合成來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用,因此在AML的治療中對(duì)阿霉素的耐藥是獲得良好療效的主要障礙.阿霉素耐藥的產(chǎn)生是多藥耐藥基因-1(multidrugresistancegene1,MDR-1)編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的過度表達(dá)所致,但是在臨床治療中許多患者耐藥的發(fā)生并不能單一以MDR-1的過表達(dá)來(lái)解釋.近年來(lái),腫瘤細(xì)胞耐藥的多重性使得人們逐漸發(fā)現(xiàn)了多藥耐藥蛋白,它亦屬于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族,共擁有9個(gè)成員,它們可以轉(zhuǎn)運(yùn)功能不同的親脂陰離子及各種藥物,是通過結(jié)合ATP將藥物泵出細(xì)胞外介導(dǎo)耐藥,其過度表達(dá)常常導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥的產(chǎn)生.在不同細(xì)胞株的培養(yǎng)中均發(fā)現(xiàn)多種MRP蛋白高表達(dá)且與抗腫瘤藥物的耐藥密切相關(guān).有研究已經(jīng)證實(shí),除了P-gp以外,MRP在AML對(duì)阿霉素的耐藥中也發(fā)揮著重要作用,而且一些未被確定的MRP蛋白的同源物也極有可能在AML的耐藥中扮演著較為重要的角色,這是因?yàn)槟骋籑RP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失后,其功能是可以被其他MRP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白替代的;上述理論已經(jīng)被在一些臨床的實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用P-gp抑制劑來(lái)逆轉(zhuǎn)AML的耐藥并沒有獲得良好的療效所解釋.以上研究均說明,除了P-gp外,MRP也在AML的耐藥中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用.MRP4可以轉(zhuǎn)運(yùn)包含內(nèi)源性及外源性底物在內(nèi)的各種有機(jī)陰離子,并且參與了MDR.已有報(bào)道顯示,MRP4在神經(jīng)母細(xì)胞瘤及急性淋巴細(xì)胞耐藥株CEM-MP5中過表達(dá),并伴隨較差的預(yù)后;同時(shí)MRP4也可能作為急性白血病患者早期造血干細(xì)胞表面標(biāo)志之一;而且研究也已證實(shí),在耐阿霉素的3種細(xì)胞株(K562/ADR,SBC-3/ADR和MCF7/ADR)中MRP5的表達(dá)明顯高于非耐藥的K562,SBC-3及MCF7細(xì)胞株,以此而證實(shí)了MRP5可作為除了MDR-1以外阿霉素耐藥的又一因素.氨基酸分析揭示,9個(gè)MRP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)均包含有2個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotidebindingdomains,NBD)及至少2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(membranespanningdomains,MSD);MRP4與MRP5結(jié)構(gòu)相似,相較其他7個(gè)MRP,它們僅有2個(gè)MSD,因此兩者也有較為相似的功能.上述資料預(yù)示,MRP4可能也參與了除MDR-1以外AML的阿霉素耐藥機(jī)制,同時(shí)我們前期的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)K562/ADR細(xì)胞株中MRP4表達(dá)較K562細(xì)胞株明顯增高,因此我們以K562/ADR細(xì)胞株作為白血病耐藥模板進(jìn)行后續(xù)研究.RNAi技術(shù)已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中的最為有效力的實(shí)驗(yàn)工具.siRNA基因沉默作用過程如下:Dicer酶將長(zhǎng)鏈的RNA分子切割成21～28bp的siRNA雙螺旋分子;參與RNA干擾作用的分子會(huì)特異性識(shí)別siRNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),并將雙螺旋結(jié)構(gòu)中的一條單鏈整合進(jìn)被稱為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)的蛋白復(fù)合物中;RISC可以切割同siRNA具有完全互補(bǔ)序列的mRNA分子或阻斷目標(biāo)mRNA的翻譯過程,從而抑制目的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),導(dǎo)致基因沉默.因此針對(duì)siRNA對(duì)目的基因mRNA的特異性降解作用使其成為腫瘤治療研究的首選實(shí)驗(yàn)工具.化學(xué)合成的siRNA簡(jiǎn)單但基因沉默效應(yīng)短暫,而攜帶載體的siRNA可以長(zhǎng)期、穩(wěn)定的表達(dá).其中慢病毒載體是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,它在基因治療中具備以下優(yōu)點(diǎn):感染效率高;不僅可以感染分裂期細(xì)胞,還能感染非分裂期細(xì)胞;感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組,繼而進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá);沒有毒性且不產(chǎn)生免疫反應(yīng)[30,31,32,33,34,35].RNAi已經(jīng)在白血病細(xì)胞株的研究中廣泛應(yīng)用,為逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥及增強(qiáng)急性髓系白血病對(duì)化療藥物的敏感性提供了可能.鑒于上述原因,我們選用慢病毒介導(dǎo)的siRNA來(lái)研究MRP4在K562/ADR細(xì)胞中的作用.我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中先構(gòu)建了5個(gè)重組的針對(duì)MRP4基因的慢病毒介導(dǎo)的shRNA(lv-shRNAs-MRP4)質(zhì)粒繼而在RKO細(xì)胞中進(jìn)行內(nèi)源性篩靶實(shí)驗(yàn).選擇RKO細(xì)胞作為內(nèi)源篩靶細(xì)胞的原因?yàn)榘籽〖?xì)胞是懸浮細(xì)胞,而RKO細(xì)胞(結(jié)腸癌細(xì)胞株)為貼壁細(xì)胞,更易于培養(yǎng);并且前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)在RKO細(xì)胞中MRP4mRNA表達(dá)增高.據(jù)real-timePCR結(jié)果,lv-shRNA1-MRP4～lv-shRNA5-MRP4靶點(diǎn)對(duì)MRP4mRNA的表達(dá)的抑制均較對(duì)照組有明顯差異,但lv-shRNA1-MRP4對(duì)RKO細(xì)胞內(nèi)MRP4基因的沉默作用更強(qiáng),沉默效率約為80%;即根據(jù)在RKO細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源篩靶結(jié)果我們選擇lv-shRNA1-MRP4作為后續(xù)K562/ADR細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的靶點(diǎn).應(yīng)用real-timePCR和WeaternBlot法檢測(cè)lv-shRNA1-MRP4對(duì)K562/ADR細(xì)胞中MRP4mRNA及蛋白表達(dá)均有顯著沉默效應(yīng).之后,運(yùn)用MTS法檢測(cè)K562/ADR細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示,lv-shRNA1-MRP4與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用后腫瘤細(xì)胞增殖活