第二十章 衛(wèi)生微生物的檢驗

第二十章

衛(wèi)生微生物的檢驗衛(wèi)生微生物檢驗的對象既包括病原微生物，也包括非致病和條件致病性微生物。標本的來源不僅局限于人體，也來源于空氣、水、食品等。第一節(jié)水的衛(wèi)生細菌學檢驗水的衛(wèi)生細菌學檢驗主要包括細菌總數(shù)、總大腸菌群及糞腸球菌檢測。細菌總數(shù)：每克（每毫升）檢樣在一定條件下（培養(yǎng)基成分、溫度、時間、pH值、需氧性質(zhì)等）培養(yǎng)后，得到1ml檢樣所含的細菌菌落總數(shù)?？偞竽c菌群：指一群經(jīng)35℃24小時能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、旭陽或兼性厭氧的革蘭陰性無芽孢桿菌。糞腸球菌：是溫血動物腸道內(nèi)的正常菌叢。一般用糞大腸桿菌與糞腸球菌之比（FC/FS)作為判斷糞便污染來源的指標。（大于4.1可認為污染來源于人體的糞便，小于0.7則來源于動物糞便。）水的衛(wèi)生細菌學標準為：每毫升飲用水中，細菌總數(shù)不得超過100個，總大腸菌群數(shù)每升水中不得超過3個。（一）細菌總數(shù)測定菌落總數(shù)——需氧情況下，35℃培養(yǎng)48h，能在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的細菌菌落總數(shù).作用：判定水體被細菌污染的程度基本操作一般包括：樣品的稀釋－－傾注平皿－－培養(yǎng)48小時－－計數(shù)報告。

三、水的細菌學檢測1、樣品的處理和稀釋

操作要求：“無菌操作”貫徹始終。充分振搖或研磨25g或25ml檢樣225mL稀釋液含有玻璃珠的滅菌玻璃瓶或乳缽1：10稀釋液。1ml1ml1ml9ml稀釋液1：1009ml稀釋液1：10009ml稀釋液1：10000減少誤差：每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管，將吸管內(nèi)液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)，并且稀釋液應充分振搖。環(huán)境要求：瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個平板不得超過15個菌落。

代表性：取固體樣品時需多采幾個部位，且經(jīng)過均質(zhì)或研磨；液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。

2、稀釋樣品的取樣和傾注平皿

每個稀釋度做兩個平皿將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉動平皿，混合均勻。1.取樣傾注平皿1：10稀釋液225mL無菌水1mL1mL9mL稀釋液1：1009mL稀釋液1：10001mL1mL1mL1mL1mL1mL1ml無菌水25g或25ml檢樣3、培養(yǎng)及計數(shù)培養(yǎng)條件：倒置于36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h計數(shù)時間：到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。菌落總數(shù)報告方式

計平皿中菌落數(shù)：肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。記下各平板的菌落總數(shù)，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。規(guī)律：不同稀釋度的菌落數(shù)應與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數(shù)應基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。報告原則菌落總數(shù)報告方式

例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個稀釋度菌落數(shù)之比菌落數(shù)(個/mL)報告方式(個/mL)10-110-210-31136516420—22760295461.632890271602.24無法計數(shù)4650513—527115—6無法計數(shù)30512—7無法計數(shù)無法計數(shù)無法計數(shù)164001.6×104377503.8×104271002.7×1045130005.1×1052702.7×102305003.1×10410-3無法計數(shù)菌落總數(shù)報告方式

計數(shù)原則：選平均菌落數(shù)在30~300之間者進行計算2.若有2個稀釋度的平均菌落數(shù)在30~300之間時，則按兩者的菌落總數(shù)之比來決定，若比值小于2應報告兩者的平均數(shù)；若大于2則報告其中較小的菌落總數(shù)。3.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，以稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。4.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。5.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30~300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。6.若所有的菌落數(shù)勻為“無法計數(shù)”時，應注明水樣的最大稀釋倍數(shù)。1.僅1個稀釋度的平均菌落數(shù)在此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報告之。7.在求同稀釋度的平均數(shù)時，若其中1個平板上有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌落約為平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均勻，則可按半平板上的菌落計數(shù)，然后乘以2作為整個平板的菌落數(shù)。4、菌落總數(shù)報告方式

菌落數(shù)的報告，按國家標準方法規(guī)定菌落數(shù)在1~100時，按實有數(shù)字報告，如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。為了縮短數(shù)字后面的零位，可用10的指數(shù)來表示。

固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升（mL）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。(二)大腸菌群測定

——國家標準采用三步法

1、檢驗查表方法

大腸菌群

——需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

乳糖發(fā)酵試驗分離培養(yǎng)證實試驗樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h，觀察是否產(chǎn)氣。將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。

根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。

較清潔樣品的三步法圖示

100mL50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液100mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL水樣10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL三步法圖示

取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中培養(yǎng)液在伊紅美蘭平板上進行劃線取有核心和帶金屬光澤的深紫色菌落進行革蘭氏染色乳糖蛋白胨培養(yǎng)液鏡檢（革蘭氏陰性菌）37℃培養(yǎng)48h證實產(chǎn)氣（陽性）結果與否37℃培養(yǎng)24h37℃培養(yǎng)24h

大腸菌群測定

2、計算方法

挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無光澤菌落；紅色、粉紅色菌落。抑制劑：膽鹽、煌綠、十二烷基硫酸鈉。

為陰性結果的水樣體積（mL）×全部水樣體積（mL）

MPN＝

1000×為陽性結果的發(fā)酵管（瓶）的數(shù)目

產(chǎn)酸判斷：紫色培養(yǎng)液變成黃色產(chǎn)氣判斷：發(fā)酵導管內(nèi)有小氣泡，如輕輕打動試管有氣泡沿管壁上浮，應考慮可能有氣體產(chǎn)生，需進一步試驗。第二節(jié)食品的微生物學檢驗食品營養(yǎng)豐富易于微生物的生長。食品的變質(zhì)可分為腐敗和酸敗。腐敗是指食品中的蛋白質(zhì)被微生物分解引起的變質(zhì)敗壞。酸敗是指食品中的脂肪或碳水化合物被微生物分解引起的變質(zhì)敗壞。樣品的采集食品微生物檢驗采集的樣品種類有大樣、中樣及小樣三種。大樣是指一整批樣品；中樣是指從樣品中各不同部分采取的混合標本，一般以200g為準；小樣又叫檢樣，是供分析用的樣品，一般以25g為準。菌落總數(shù)的檢驗菌落總數(shù)是判定食品被污染程度的指標，也可觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，為被檢樣品的衛(wèi)生學評價提供依據(jù)。1.檢樣的處理與稀釋2.傾注培養(yǎng)3.菌落計數(shù)及報告計數(shù)平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或每毫克）樣品所含菌落總數(shù)。大腸菌群的檢驗1.檢樣稀釋2.乳糖發(fā)酵實驗將待檢樣品接種在乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，置35℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，進行下述實驗。3.分離培養(yǎng)將上述培養(yǎng)物轉種在伊紅美藍瓊脂平板上置35℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)10-24小時，觀察菌落形態(tài)，作革蘭染色和證實實驗。4.證實實驗挑取可疑大腸菌群菌落進行革蘭染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置35℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，觀察產(chǎn)氣情況，凡分解乳糖產(chǎn)氣、革蘭染色陰性的無芽孢桿菌，即報告為大腸菌群陽性。5.報告糞大腸菌群的檢驗用提高培養(yǎng)溫度的方法，將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長的大腸菌群，稱為糞大腸菌群。1.44℃乳糖發(fā)酵試驗2.分離培養(yǎng)3.證實試驗在蛋白胨水內(nèi)加入靛基質(zhì)試劑，若靛基質(zhì)試驗陽性，則證實為糞大腸菌群。4.報告細菌性食物中毒的檢驗細菌性食物中毒是指食用含大量細菌和（或）細菌毒素所污染的食物而發(fā)生的中毒。細菌性食物中毒發(fā)病急、病程短，不進食者不發(fā)病。（一）樣品的采集與處理（二）檢驗1.直接涂片2.活菌數(shù)的測定3.分離培養(yǎng)：需氧、厭氧4.動物試驗5.血清學試驗：急性期和恢復期的血清作凝集試驗（三）常見食物中毒的細菌學檢驗1.沙門菌屬食物中毒的檢驗2.大腸埃希菌食物中毒的