實驗四提取理化性質(zhì)及含量測定

實驗四葉綠體色素的提取、理化性質(zhì)與含量測定

提取葉綠體色素分析葉綠體色素的物理、化學(xué)性質(zhì)測定葉綠素含量提取和測定植物組織中的光合色素是研究光合作用機理的重要技術(shù)手段。1.實驗?zāi)康募耙饬x2.1用含水的有機溶劑提取葉綠素2.實驗原理親水的“頭部”：鎂原子居于卟啉環(huán)的中央，帶正電性，與其相聯(lián)的氮原子則偏向于帶負(fù)電性，因而卟啉具有極性，是親水的，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合。親脂的“尾巴”：葉綠醇是由四個異戊二烯單位組成的雙萜，是一個親脂的脂肪鏈，它決定了葉綠素的脂溶性。純的有機溶劑不能打破葉綠體色素與蛋白質(zhì)的聯(lián)系，所以必須用能與水混溶的有機溶劑并有少量水存在時，才能將葉綠體色素提取出來。80%丙酮95%乙醇丙酮:乙醇:水(4.5:4.5:1)2.2葉綠素的物理性質(zhì)1）葉綠素的吸收光譜紅光區(qū)：640~660nm籃紫光區(qū)：430~450nm胡蘿卜素和葉黃素：400~500nm不用藍光區(qū)測葉綠素含量。2）熒光現(xiàn)象葉綠素溶液在透射光下呈綠色，而在反射光下呈紅色的現(xiàn)象。2.3葉綠素的化學(xué)性質(zhì)葉綠素是葉綠酸的酯（葉綠酸是雙羧酸，其中一個羧基被甲醇酯化，另一個被葉綠醇酯化）。葉綠素可以與堿起皂化反應(yīng)而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，用此法可將葉綠素與類胡蘿卜素分開。1）皂化反應(yīng)皂化分層葉綠酸的鹽形成以后，因分子極性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能進入苯層；而類胡蘿卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中；一部分苯分散在水中形成乳膠體，出現(xiàn)一層乳白色的溶液。

低溫下發(fā)生皂化反應(yīng)的葉綠體色素溶液，易乳化而出現(xiàn)白色絮狀物，溶液渾濁，且不分層。2）取代反應(yīng)卟啉環(huán)中的Mg處于不穩(wěn)定的狀態(tài)，可被H+、Cu2+

、Zn2+等離子取代。稀酸：葉綠素溶液與稀酸作用，Mg可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，去鎂葉綠素遇Cu2+則成為深綠色的銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞（常用醋酸銅處理來保存綠色植物標(biāo)本）。濃酸：葉綠素溶液與濃酸作用，Mg被H+取代，且生成的去鎂葉綠素迅速分解出葉綠醇，并形成去鎂葉綠酸，呈褐綠色。1）吸收光譜紅光區(qū)：640~660nm；籃紫光區(qū)：430~450nm。2）熒光現(xiàn)象葉綠素溶液在透射光下呈綠色，而在反射光下呈紅色。3）皂化反應(yīng)葉綠素是葉綠酸的酯，可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，用此法可將葉綠素與類胡蘿卜素分開。

4）取代反應(yīng)在稀酸中，葉綠素中的鎂可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇Cu2+則成為綠色的銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞。在濃酸中，葉綠素中的Mg被H+取代，且生成的去鎂葉綠素迅速分解出葉綠醇，并形成去鎂葉綠酸，呈褐綠色。

5）葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強光的破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。葉綠素的理化性質(zhì)1）葉綠素a、b分別在665nm和649nm波長處（95%乙醇提?。┯凶畲蟮奈辗?，同時在該波長處葉綠素a，b的比吸收系數(shù)K為已知，我們即可以根據(jù)Lambert-Beer定律，列出以下關(guān)系式：

Ca=13.95A665–6.88A649

Cb=24.96A649–7.32A665

CT=Ca+Cb=18.08A649+6.63A665A665和A649為葉綠素溶液在波長665nm和649nm時的吸光度Ca、Cb、CT分別為葉綠素a、

b及總的濃度，以mg·L-1為單位2）葉綠素a、b在652nm波長處有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5），在此波長下測定葉綠素溶液的吸光度，也可計算出葉綠素a、b的總濃度。

CT=（A652×1000）÷34.53）葉綠素的含量（mg/g）=[葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)]/樣品鮮重2.4葉綠素含量的計算3.材料、儀器設(shè)備與試劑材料：菠菜葉片儀器：試管、容量瓶、研缽、分光光度計、水浴鍋，等。試劑：石英砂、碳酸鎂、95％乙醇、20%NaOH-甲醇、苯、36%乙酸、醋酸銅、濃鹽酸

葉綠體色素提取

稱取新鮮去大葉脈的菠菜葉片3g，剪碎放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鎂及5ml95％乙醇，研成均漿，過濾入25ml容量瓶，分別用5ml95％乙醇沖洗研缽3次，沖洗液同樣過濾，收集濾液，倒入容量瓶中，最后用95％乙醇定容至25ml，放入暗處備用。2.光對葉綠體色素的破壞作用

取兩支試管，各加入葉綠體色素提取液2ml，一管放在直射光下，另一管放在黑暗處，1～2h后觀察兩管溶液顏色有何變化？3.葉綠素的熒光現(xiàn)象

取葉綠素提取液3ml放入試管中，在直射光下觀察溶液的透射光及反射光的顏色有何不同？

4.實驗步驟4.葉綠素的皂化作用

提取液3ml

+1ml20%NaOH-甲醇（搖勻）冷卻+3ml苯（搖勻）

+3ml蒸餾水（逐滴加，搖勻）靜置，觀察分層現(xiàn)象。下層是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的葉綠素a和b（以及少量的葉黃素）；上層是苯溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。

對照：另取2ml葉綠體色素提取液，加入2ml苯和2ml蒸餾水觀察與皂化的葉綠素有何不同？60℃水浴3min5.H+和Cu2+對葉綠素分子中Mg2+的取代作用1）吸取葉綠體色素提取液2ml放入試管中，逐滴加入36%乙酸數(shù)滴，搖勻，觀察溶液顏色的變化。

2）當(dāng)溶液變褐色后，傾出一半于另一試管中，投入幾粒醋酸銅粉，水浴加熱，觀察溶液顏色變化，與未加醋酸銅（同時加熱）的一管相比較。3）吸取葉綠體色素提取液2ml放入試管中，逐滴加入濃鹽酸，觀察顏色變化。

6.葉綠體色素含量測定吸取葉綠體色素提取液5ml，用95%乙醇定容至50ml。以95%乙醇為空白對照，在波長665nm、649nm、652nm下測定吸光度，并分別計算葉綠素a和葉綠素b的濃度（Ca、Cb：mg/L），二者之和為總?cè)~綠素的濃度。最后，根據(jù)下式可進一步求出植物組織中葉綠素的含量：

葉綠素的含量（mg/g）=[葉綠素的濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積]/樣品鮮重比較兩種方法所得的實驗結(jié)果。

5.結(jié)果與分析詳見實驗步驟6.注意事項1）為了避免葉綠素的光分解，操作時應(yīng)在弱光下進行，研磨時間應(yīng)盡量短些，以不超過2分鐘為宜。2）葉綠體色素提取液不能渾濁，否則應(yīng)重新過濾。3）分光光度計的正確使用(更換波長后要調(diào)0)。1）用不含水的有機溶劑提取植物材料特別是干材料的葉綠體色素往往效果不佳，原因何在？2）研磨提取葉綠素時加入MgCO3，有什么作用？3）葉綠素a、葉綠素b在藍光區(qū)也有吸收峰，能否用這一吸收峰波長進行葉綠素a、葉綠素b的定量分析？為什么？7.思考