響應(yīng)面法優(yōu)化制備抗氧化肽的酶解工藝

響應(yīng)面法優(yōu)化制備抗氧化肽的酶解工藝

在美國的糖生產(chǎn)過程中，所產(chǎn)生的葡萄糖副產(chǎn)品的米渣蛋白含量超過60%，俗稱米渣蛋白粉。米蛋白被公認為優(yōu)質(zhì)食源蛋白,氨基酸接近WHO/FAO理想模式,但多年來僅作為下腳料低價出售給飼料廠,資源浪費嚴重。近年來,研究發(fā)現(xiàn),大米蛋白不僅具有重要的營養(yǎng)價值而且還具有一定的保健功能,如抗糖尿病、抗膽固醇、抗癌變等功效。但是,目前對米渣蛋白活性肽的研究很少,對米渣蛋白抗氧化肽的研究也鮮見,而對玉米和豆類蛋白活性肽已有相當數(shù)量的研究報道。米渣抗氧化肽不僅具有較強的還原能力,而且無毒無副作用,因而對它的研究開發(fā)具有十分重要的意義。1材料和方法1.1儀器和儀器米渣:江西省恒天實業(yè)有限公司;復(fù)合胰蛋白酶:活力4kU/g,無錫市酶制劑廠;氫氧化鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵:分析純。JB-3型磁力攪拌器:上海雷磁新徑儀器有限公司;電子天平:瑞典Mettlertoledo儀器公司;WYT-J0-32%手持糖度計:成都興晨光光學(xué)儀器有限公司;PHS-3C精密pH計:上海雷磁新徑儀器有限公司;T6系列紫外可見分光光度計:北京普忻通用儀器有限公司。1.2方法1.2.1米渣反應(yīng)的制備過程是制備米渣米渣→加水→調(diào)節(jié)pH值→調(diào)溫→加酶→酶解(調(diào)pH)→滅酶→離心→酶解液→分析測定。1.2.2樣品溶液的制備抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基的,還原力越強,抗氧化性越強,因此可通過測定還原力來說明抗氧化活性的強弱。還原性測定方法如下:取一定濃度樣品1mL,加入磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L,pH=6.6)2.5mL和1%鐵氰化鉀2.5mL,置于50℃水浴中反應(yīng)20min,然后加入10%的三氯乙酸5mL,經(jīng)充分混合后以3000r/min離心10min。吸取上清液2.5mL,加入2.5mL蒸餾水和0.5mL0.1%的三氯化鐵溶液,在700nm處測定吸光值,吸光值增加表明還原力增強。2結(jié)果與分析2.1酶分解條件對米渣異基因的制備有影響2.1.1h值對米渣抗氧化肽制備的影響在溫度55℃、水料比為10、時間2h的條件下,研究不同pH值對米渣抗氧化肽制備的影響,結(jié)果如圖1所示。隨著pH的變化,米渣抗氧化肽的抗氧化活性呈現(xiàn)先增后減的趨勢,當pH為7.5時,抗氧化活性最強,因此pH在7.5為最佳范圍。2.1.2制備溫度對米渣抗氧化肽制備的影響在pH7.5,水料比為10,時間2h的條件下,研究不同溫度對米渣抗氧化肽制備的影響,結(jié)果如圖2所示。在55℃時,抗氧化活性最強,此后溫度再升高,抗氧化活性下降,因此溫度應(yīng)在55℃。2.1.3間對米渣抗氧化肽制備的影響在pH7.5、溫度55℃、水料比為10的條件下,研究不同時間對米渣抗氧化肽制備的影響,結(jié)果如圖3所示。在米渣蛋白酶解過程中,隨著時間的增加,米渣抗氧化肽的抗氧化活性逐步增強,當酶解2.5h后,抗氧化活性有所下降,因此時間以2.5h為最佳。2.1.4不同水料比對米渣抗氧化肽制備的影響在pH7.5、溫度55℃、時間2.5h的條件下,研究不同水料比對米渣抗氧化肽制備的影響,結(jié)果如圖4所示。一定范圍內(nèi)隨著水料比的增加,抗氧化活性逐漸增強,當水料比達到10以后,抗氧化活性有所下降,因此水料比以10為宜。2.2采用響應(yīng)面法，優(yōu)化了米渣氧化反應(yīng)的制備2.2.1多因素試驗設(shè)計根據(jù)CentralCompositeDesign(CCD)設(shè)計原理,選取酶解pH值、時間、溫度和水料比4個影響因素,在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用4因素5水平的響應(yīng)曲面法進行分析。試驗因素與水平設(shè)計見表1,擬合二次多項模型的CCD設(shè)計見表。2.2.2米渣抗氧化肽制備工藝模型式中:Y為響應(yīng)值(還原能力)。對該模型進行方差分析,結(jié)果見表3?；貧w模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表4。由表3可知,模型的P值小于0.0001<0.05,說明模型極顯著;失擬項P值為0.3287>0.05,不顯著;該模型的決定系數(shù)為0.9457,說明其擬合程度良好,試驗誤差小,可以用此模型來分析和預(yù)測米渣抗氧化肽制備工藝結(jié)果。AdeqPrecision值為17.359,遠大于4,說明模型完全可以用來對試驗結(jié)果進行擬合。由表4可知,模型的一次項A、B、C對米渣抗氧化肽制備的線性效應(yīng)顯著,D不顯著,各因素影響程度從大到小依次排列為B、C、A、D,其中B、C的一次相系數(shù)絕對值較大,有著較大的F值和很小的P值,說明二者是米渣抗氧化肽制備的限制因素;二次項對米渣抗氧化肽制備的曲面效應(yīng)都極顯著;交互項AC、BD、CD交互效應(yīng)極顯著,其他交互效應(yīng)不顯著;表明各影響因素對米渣抗氧化肽制備的影響不是簡單的線性關(guān)系。2.2.3各因素交互作用分析制備米渣抗氧化肽的響應(yīng)曲面及其等高線見圖5~圖10。6組圖直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則與之相反。比較6組圖可知,pH和溫度、時間和水料比、溫度和水料比之間的交互作用顯著,與表4分析結(jié)果一致。為進一步確定最佳點,在模型濃度范圍內(nèi)選擇出發(fā)點,按照模型使用快速上升法進行優(yōu)化,可得米渣抗氧化肽制備的最佳方案為pH值7.5634、時間2.0065h、溫度52.255℃、水料比9.07。2.2.4水料比95考慮到實際操作的便利,結(jié)合上述優(yōu)化條件,取工藝參數(shù)pH值7.56,時間2h,溫度52℃,水料比9進行驗證試驗。平行做5次,測得的平均吸光度為0.688,通過OriginPro7.0軟件計算,在設(shè)定顯著性水平P<0.01前提下,預(yù)測值和實際值無顯著性差異,表明預(yù)測結(jié)果實際可行。3米渣抗氧化肽的還原力通過二次回歸設(shè)計得到了米渣抗氧化肽的還原力與米渣酶解pH值、時間、溫度和料液比之間的回歸模型,經(jīng)檢驗證明該模型合理可靠,能較好地預(yù)測米渣抗氧化肽的制備。通過對模型的響應(yīng)面及其等高線分析,得到優(yōu)化的工藝參數(shù)為pH值7.56、時間2h、溫度52℃、水料比9,在此條件下,米渣抗氧化肽的平均還原力(即吸光度)可達0.688。對表2試驗數(shù)據(jù)進