第5章 酶學(xué)分析

第五章酶學(xué)分析技術(shù)1酶（enzyme）的本質(zhì)：高度特異性、高度不穩(wěn)定性，高效性、可調(diào)節(jié)性酶的應(yīng)用：由活細(xì)胞產(chǎn)生的能高效催化特異生化反應(yīng)的蛋白質(zhì)，屬于生物催化劑酶的特點(diǎn)：酶活性的檢測(cè)、代謝物的酶學(xué)分析和同工酶及亞型測(cè)定用于臨床診斷和療效判斷2主要內(nèi)容：酶活性測(cè)定的基本知識(shí)酶活性單位的計(jì)算與校準(zhǔn)酶活性的測(cè)定代謝物的酶法檢測(cè)同工酶測(cè)定3掌握酶活性單位的表示方法與計(jì)算、酶活性測(cè)定的定時(shí)法與連續(xù)監(jiān)測(cè)法、代謝物的酶法測(cè)定。熟悉酶促反應(yīng)進(jìn)程、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、酶活性測(cè)定的直接法與間接法、酶活性測(cè)定的影響因素。了解同工酶產(chǎn)生的機(jī)理與測(cè)定方法、酶活性單位的校準(zhǔn)、工具酶的應(yīng)用。教學(xué)要求：4第一節(jié) 酶活性測(cè)定的基本知識(shí)酶測(cè)定絕對(duì)定量法（酶量直接測(cè)定法）：免疫學(xué)方法相對(duì)定量法（酶活性間接測(cè)定法）：生化檢測(cè)方法

EE5簡(jiǎn)介內(nèi)容：一、酶活性二、酶活性單位與酶活性濃度三、酶促反應(yīng)進(jìn)程四、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)6一、酶活性定義：酶活性（enzymeactivity）也稱為酶活力，指酶促反應(yīng)速率，即規(guī)定條件下在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量或底物的減少量。表示方法：

或

式中v：反應(yīng)速率，[P]：產(chǎn)物濃度，t：時(shí)間，[S]：底物濃度。7二、酶活性單位與酶活性濃度（一）酶活性單位定義：表示酶的相對(duì)含量，指在一定條件下，單位時(shí)間內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所催化的酶量。表示方法：慣用單位（一定的反應(yīng)量/一定的反應(yīng)時(shí)間）國際單位IU（μmol/min）Katal單位（mol/s）81．慣用單位：20世紀(jì)60年代以前根據(jù)酶活性測(cè)定方法建立者的姓氏命名的單位ALP的金氏單位（King）氨基移轉(zhuǎn)酶的卡門氏單位（Karmen）特點(diǎn)：各單位對(duì)溫度、時(shí)間、物質(zhì)量的定義不同，導(dǎo)致各測(cè)定值、參考范圍相差很大，彼此間無法比較,現(xiàn)在臨床應(yīng)用較少?？ㄩT氏單位：1.0ml血清在25℃，340nm，反應(yīng)體積3.0ml,光徑1.0cm時(shí)每分鐘測(cè)定吸光度下降0.001，即消耗4.82

10-4μmolNADH為一個(gè)卡門氏單位舉例：金氏單位：100ml血清ALP在37℃與底物作用15min，產(chǎn)生1mg酚。92.國際單位IU（μmol/min）定義：在規(guī)定條件下（25℃及其他最適條件），每min催化1μmol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量，為1IU或1U，1IU=1μmol/min。IFCC,2001年37℃3．Katal單位定義：1Katal是在規(guī)定條件下，每秒鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量。1Katal＝1mol/s。IU與Katal單位的關(guān)系：1katal=60×106IU，1IU=16.67nkatal10（二）酶活性濃度酶活性濃度指單位體積樣本中的酶活性單位。國際單位用IU/L或U/L表示。酶活性濃度才具有臨床可比性，但其多數(shù)情況下都被不嚴(yán)格地稱為酶活性單位乃至酶活性.11三、酶促反應(yīng)進(jìn)程以產(chǎn)物生成量（或反應(yīng)物減少量）為縱坐標(biāo)、反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖所得到的一條曲線，稱為反應(yīng)進(jìn)程曲線（或反應(yīng)時(shí)間曲線、速率曲線、時(shí)間曲線）t1t2時(shí)間t圖5-1酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線吸光度A延滯期線性期非線性期12（一）延滯期（lagphase、延遲期

）特點(diǎn)：為反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)速率一開始時(shí)較慢，通常為幾秒到幾分鐘t1t2時(shí)間t圖5-1酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線吸光度A線性期非線性期R1R2延滯期孵育期延滯期13（二）線性期此階段酶促反應(yīng)速率基本保持恒定；對(duì)底物而言，為反應(yīng)速率與底物濃度[S]的零次方成正比的零級(jí)反應(yīng)，即不受底物濃度的影響，而只與酶活性濃度成正比；

此時(shí)底物的消耗量小于5%，反應(yīng)速率為反應(yīng)初速率。酶活性濃度越高，線性期就越短

線性度：判斷線性期的一個(gè)指標(biāo)，指吸光度（A）相對(duì)于時(shí)間（min）變化的可以接受的程度。

線性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％線性度值越小則線性越好。一般判斷標(biāo)準(zhǔn)：不大于15％，否則判為非線性特點(diǎn)：可代表酶促反應(yīng)速度14（三）非線性期（偏離線性期、平坦期）進(jìn)入非線性期的原因：反應(yīng)的不斷進(jìn)行，底物消耗越來越多，酶變性失活增加、可逆反應(yīng)增強(qiáng)、產(chǎn)物抑制增加等使得反應(yīng)速率明顯下降。特點(diǎn)：若為單底物的反應(yīng)，則此時(shí)反應(yīng)速率與單底物濃度[S]的一次方成正比，為一級(jí)反應(yīng)。15四、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究?jī)?nèi)容：研究酶促反應(yīng)的速率及其各種影響因素（如底物濃度、酶活性濃度、溫度、pH、激活劑和抑制劑等）的科學(xué)指導(dǎo)選擇底物種類、確定底物濃度，確定最適溫度、最適pH、激活劑和抑制劑類型與含量等，從而準(zhǔn)確測(cè)定酶活性或代謝物濃度。研究意義:16（一）酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)式米氏方程：K417（二）Km的含義與意義1．Km的含義:

當(dāng)Km=[S]時(shí)，，可見Km值等于反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率Vmax一半時(shí)的底物濃度。2．Km的意義Km是酶的一個(gè)特征性常數(shù)（其他如等電點(diǎn)），Km的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)反映酶對(duì)底物親和力的大小選擇酶的最適底物或天然底物計(jì)算不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)程度

鑒別酶的種類

判斷可逆反應(yīng)的速率

判斷酶偶聯(lián)反應(yīng)的限速反應(yīng)計(jì)算工具酶的用量18（三）Vmax的含義定義：Vmax表示在一定酶量時(shí)的最大反應(yīng)速率，即酶完全被底物所飽和時(shí)的反應(yīng)速率，與酶活性濃度呈正比。應(yīng)用：計(jì)算酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（TN，催化常數(shù)Kcat）單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子將底物分子轉(zhuǎn)換成產(chǎn)物的最大值。計(jì)算公式為：

(單位是s-1)計(jì)算時(shí)要保證酶的濃度單位與底物的濃度單位一致）19（四）Km和Vmax的測(cè)定1、雙倒數(shù)作圖法：縱軸截距為斜率為橫軸截距為

Linweaver-Burk作圖法20利用此圖還可用于判斷可逆性抑制反應(yīng)的性質(zhì)：如競(jìng)爭(zhēng)性抑制：為表觀KmKmKm21第二節(jié)酶活性單位的計(jì)算與校準(zhǔn)一、酶活性單位的計(jì)算（掌握）二、酶活性單位的校準(zhǔn)（了解）內(nèi)容簡(jiǎn)介：22一、酶活性單位的計(jì)算（一）通用公式前提條件：必須保證啟始底物量充足（[S]》Km），使酶促反應(yīng)處于零級(jí)反應(yīng)期即線性期，反應(yīng)初速率等于最大反應(yīng)速率，從而使酶發(fā)揮最大活性——mu與酶活性正相關(guān)，而與啟始底物量無關(guān)23注釋：式中U：酶活性單位數(shù)，m0：規(guī)定的產(chǎn)物生成量或底物消耗量，V0：規(guī)定的樣本體積，t0：規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間，mu：實(shí)際產(chǎn)物生成量或底物消耗量，Vu：實(shí)際樣本體積，tu：實(shí)際反應(yīng)時(shí)間實(shí)測(cè)的酶活性大小規(guī)定的酶活性單位(5.1)24（二）采用酶活性慣用單位的計(jì)算公式常用設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)管（校準(zhǔn)管）的對(duì)比法（簡(jiǎn)稱對(duì)比法、比較法）測(cè)量吸光度的變化求出。

特點(diǎn)：校準(zhǔn)管并不含酶常用定時(shí)法（固定時(shí)間法）求ΔA,ΔA=A終止點(diǎn)-A空白也可用不設(shè)校準(zhǔn)管的比爾定律摩爾吸光系數(shù)法求出mu的確定方法：25慣用單位的計(jì)算公式：測(cè)定產(chǎn)物生成類的計(jì)算公式測(cè)定底物消耗類的計(jì)算公式根據(jù)測(cè)定對(duì)象261、測(cè)定產(chǎn)物生成類的計(jì)算公式mu為生成的產(chǎn)物量，反應(yīng)后從無到有，其存在量即生成量，與酶活性成正比常規(guī)計(jì)算方法和公式：設(shè)立一個(gè)校準(zhǔn)管，與測(cè)定管同步操作。特點(diǎn)：

·Cc=Cu△Au：測(cè)定管吸光度，△Ac：校準(zhǔn)管吸光度，Cc：校準(zhǔn)物摩爾濃度，Vc：校準(zhǔn)物體積Mu=Cu×Vc（5.2）27校準(zhǔn)曲線法和公式：設(shè)立多個(gè)校準(zhǔn)管制備△A-U校準(zhǔn)曲線，測(cè)出△A值后查出U值其中，k1和△Ac都是變量，隨不同的Vc而呈比例變化。上相當(dāng)于直線方程Y=bX。

圖5-3縱坐標(biāo)上某一點(diǎn)△Au(=△Ac)相對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)U值為k1。各校準(zhǔn)管所相當(dāng)?shù)拿富钚詥挝粩?shù)k1可由其不同的Vc代入公式算出。（）

(5.3)28測(cè)定管：血清0.1ml加底物液等后于37℃水浴15min，再加顯色液顯色。同時(shí)，設(shè)立除先不加血清、其它步驟相同的空白管（在反應(yīng)最后加血清），510nm處以空白管調(diào)零測(cè)出△Au。校準(zhǔn)管：以校準(zhǔn)曲線中第2管為例。取0.05mg/ml的酚校準(zhǔn)液0.4ml，加顯色液等至總體積與測(cè)定管相等，用蒸餾水替代酚校準(zhǔn)液、其它步驟相同的空白管調(diào)零，510nm處測(cè)出△Ac?！居?jì)算】

由式5.2有：

可見，第2管相當(dāng)于酶活性單位為：20金氏單位/100ml血清，常簡(jiǎn)寫為20金氏單位?！締挝欢x】1金氏單位：100ml血清ALP在37℃與底物作用15min，產(chǎn)生1mg酚?！静僮鳌坷?金氏法測(cè)定血清ALP。292．測(cè)定底物消耗類的計(jì)算公式

mu為消耗的底物量，反應(yīng)后從多到少

在測(cè)定底物消耗類時(shí)，將不加樣本不加底物而加蒸餾水、其他操作與測(cè)定管相同的操作管稱為空白管；

將不加樣本而加蒸餾水、其他操作與測(cè)定管相同的操作管稱為“對(duì)比”校準(zhǔn)管（校準(zhǔn)管）?？瞻坠懿缓械孜??！皩?duì)比”校準(zhǔn)管與測(cè)定管反應(yīng)前底物量相同。特點(diǎn)：?jiǎn)我恍?zhǔn)管即“對(duì)比”校準(zhǔn)管時(shí)的測(cè)定：因產(chǎn)物生成量與底物消耗量相等，將式5.2中代表產(chǎn)物生成量的△Au換成代表底物消耗量的△Ac-△Au后有：

計(jì)算方法和公式：（5.4）30例：碘色法測(cè)定血清淀粉酶（AMS）【單位定義】1慣用單位：100ml血清AMS在37℃15min，水解5mg淀粉。【操作】

測(cè)定管：稀釋10倍后的血清0.2ml中加0.4g/L的淀粉溶液1ml37℃水浴7.5min