第十章 基因工程生化產(chǎn)品制備原理及方法

生化工藝學(xué)課件

第十章基因工程生化產(chǎn)品制備原理及方法第十章基因工程生化產(chǎn)品制備原理及方法§10.1概述§10.2基因工程生化產(chǎn)品的制備程序§10.3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化§10.4非大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)§10.5工程菌的發(fā)酵§10.6基因工程生化產(chǎn)品的分離純化§10.7基因工程生化產(chǎn)品的質(zhì)量控制§10.8重組白細(xì)胞介素-2的制備§10.9干擾素的制備§10.10人胰島素的制備§10.1概述生物技術(shù)最為活躍的研究領(lǐng)域?yàn)獒t(yī)學(xué)領(lǐng)域→集中于開展活性蛋白和多肽類藥物及單克隆抗體的研究人類基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)研究的進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與植物、蛋白質(zhì)工程、抗體工程、基因治療和生物芯片等新技術(shù)的建立且取得重大突破與發(fā)展→新型生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)第一個(gè)生物技術(shù)藥物：人胰島素，1982年生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)1993年生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品銷售達(dá)77億美元，2000年已超過(guò)200億美元已得到臨床應(yīng)用的基因工程藥物有：人胰島素、人生長(zhǎng)激素、干擾素、乙肝疫苗、人促紅細(xì)胞生成素（EPO）、GM－集落刺激因子（GM－CSF）、組織溶纖酶原激活素、白細(xì)胞介素－2及白介素－11等。正在研究的有降鈣素因子、腫瘤壞死因子、表皮生長(zhǎng)因子等140多種。隨著生物技術(shù)藥物的發(fā)展，多肽與蛋白質(zhì)類藥物的研究與開發(fā)，已成為醫(yī)藥工業(yè)中一個(gè)重要的領(lǐng)域，同時(shí)給生物制劑帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)藥物的應(yīng)用限制實(shí)際應(yīng)用中，蛋白質(zhì)類藥物受到一定限制，大多數(shù)只能注射給藥或局部用藥。Why？為克服這些缺陷→合成這些天然蛋白質(zhì)的較小活性片段，即“多肽模擬”或“多肽結(jié)構(gòu)域”，又叫“小分子結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(jì)”?？煽诜?，有利于由皮膚、粘膜給藥，用于治療免疫缺陷癥、HIV感染、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，其制造成本也更低。該設(shè)計(jì)思想也已應(yīng)用于多糖類藥物、核酸類藥物和模擬酶的有關(guān)研究。小分子藥物設(shè)計(jì)屬于第二代結(jié)構(gòu)相關(guān)性藥物設(shè)計(jì)，能替代原先天然活性蛋白與特異靶相互作用口服應(yīng)用時(shí)生物利用度低，會(huì)受到消化酶的破壞，在胃酸作用下不穩(wěn)定，在體內(nèi)半衰期較短在給藥方式的研究方面，對(duì)注射用溶液和注射用無(wú)菌粉末（目前上市的多肽蛋白質(zhì)類藥物多為此種劑型），除了繼續(xù)改進(jìn)其穩(wěn)定性外，還通過(guò)一些其他技術(shù)手段，研制出了化學(xué)修飾型、控釋微球型和脈沖式給藥系統(tǒng)。如PEG修飾能有效地改善多肽蛋白質(zhì)類藥物的免疫原性，增加穩(wěn)定性，延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期，減少毒副作用等。PEG-腺苷脫胺酶已投放市場(chǎng)，PEG-天冬酰胺酶，PEG-IL-2，PEG-SOD，均已進(jìn)入臨床。非注射途徑的給藥如鼻腔、直腸、肺部給藥方面也取得重大進(jìn)展?；蚬こ趟幬锏难芯窟M(jìn)展第一代基因工程藥物是針對(duì)因缺乏天然內(nèi)源性蛋白所引起的疾病。應(yīng)用基因工程技術(shù)去擴(kuò)大這類多肽蛋白質(zhì)的產(chǎn)量以替代或補(bǔ)充體內(nèi)對(duì)這類活性多肽蛋白質(zhì)的需要，主要是以蛋白質(zhì)激素類為代表的，如人胰島素、胰高血糖素、人生長(zhǎng)激素、降鈣素、生長(zhǎng)激素及α-EPO等。第二代基因工程藥物是根據(jù)內(nèi)源性多肽蛋白的生理活性，應(yīng)用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)這些極為稀有物質(zhì)，以超正常濃度劑量供給人體，以激發(fā)它們的天然活性作為其治療疾病的藥理基礎(chǔ)，主要是以細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子為代表的，如G-CSF，GM-CSF，α-IFN，γ-IFN和tPA等?；蚬こ趟幬锏难芯窟M(jìn)展應(yīng)用重組DNA技術(shù)表達(dá)人源性抗體或?qū)⒖贵w小型化(如Fab抗體，單鏈抗體、單域抗體，分子識(shí)別抗體等)，與非人源化抗體和完整抗體相比，其免疫原性弱，穿透力強(qiáng)，表達(dá)效率高。人源化抗體藥物和小型化抗體靶向藥物正成為腫瘤治療，自身免疫性疾病，器官移植排斥和艾滋病防治藥物的又一研究熱點(diǎn)。

利用微生物發(fā)酵、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)基因工程藥物是目前工業(yè)化生產(chǎn)基因工程藥物的最主要方法。從1982年重組胰島素批準(zhǔn)上市以來(lái)，現(xiàn)已有近40種基因工程蛋白質(zhì)藥物投放市場(chǎng)，主要用于治療癌癥、血液病、艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、細(xì)菌感染、骨損傷、創(chuàng)傷、代謝病等疑難病。近年來(lái)，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)基因工程疫苗和利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)基因工程人類蛋白質(zhì)藥物的研究也取得重大進(jìn)展。1、轉(zhuǎn)基因植物基因工程疫苗1990年以來(lái)利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)基因工程疫苗的研究得到了迅速的發(fā)展。將抗原基因?qū)胫参?，讓其在植物中表達(dá)，人或動(dòng)物攝入該植物或其中的抗原蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生對(duì)某抗原的免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗的研究主要集中在煙草、馬鈴薯、蕃茄、香蕉等植物。

2、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程藥物利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)基因工程人類蛋白質(zhì)藥物，其成本較微生物發(fā)酵、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)基因工程藥物大大降低→近年不少研究者從事轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程藥物的研究。基本方法：將藥用蛋白質(zhì)基因連接到乳汁蛋白質(zhì)基因的調(diào)節(jié)元件下游，然后將連接產(chǎn)物顯微注射到哺乳動(dòng)物受精卵或胚胎干細(xì)胞，當(dāng)轉(zhuǎn)基因胚胎長(zhǎng)成個(gè)體后，在泌乳期藥用蛋白質(zhì)基因表達(dá)，從動(dòng)物乳汁可獲得基因工程藥物。2、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器1988年開始在大哺乳動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器中表達(dá)基因工程藥物以來(lái)，在動(dòng)物的奶汁中生產(chǎn)出的人類蛋白質(zhì)藥物：牛奶：抗凝血酶、纖維蛋白原、人白血清蛋白、膠原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白C等；山羊奶：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、生育激素、血清白蛋白、組織型溶纖維原激活因子、單克隆抗體；綿羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纖維蛋白原、蛋白質(zhì)C，豬奶中亦有蛋白質(zhì)C、凝血因子IX、纖維蛋白原、血紅蛋白。乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程藥物的研究已取得了一些成功經(jīng)驗(yàn)，但離商業(yè)化生產(chǎn)還有距離。

§10.2基因工程生化產(chǎn)品的制備程序現(xiàn)代生物技術(shù)生化產(chǎn)品：將生物體內(nèi)生物活性物質(zhì)的基因分離出來(lái)，然后用重組DNA技術(shù)加以改造，使其在細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中大量表達(dá)，通過(guò)這種方式生產(chǎn)的新型生化產(chǎn)品基因工程技術(shù)：將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌或細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)→使得很多從自然界很難或不能獲得的蛋白質(zhì)得以大規(guī)模合成一、基因工程研發(fā)的程序1）制備基因工程菌株（或細(xì)胞）及實(shí)驗(yàn)室小試階段→主要涉及到DNA重組技術(shù)（基因工程上游技術(shù)）2）中試與質(zhì)量檢定階段→主要涉及基因工程產(chǎn)物的分離、純化（基因工程下游技術(shù)）3）臨床前研究階段4）臨床試驗(yàn)階段5）試生產(chǎn)階段二、基因工程的基本過(guò)程通過(guò)對(duì)核酸分子的剪接、重組和插入而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)重新組合，再借助質(zhì)粒、病毒、細(xì)菌或其它載體，將重組基因轉(zhuǎn)移到新宿主細(xì)胞，使其在新宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)復(fù)制和表達(dá)1）目的基因的制備2）載體的制備3）目的基因與載體的連接4）將含目的基因的表達(dá)載體引入受體細(xì)胞并在其中復(fù)制表達(dá)5）篩選帶有重組目的基因的轉(zhuǎn)化子6）鑒定目的基因的表達(dá)產(chǎn)物基因工程生化藥物的生產(chǎn)上游階段：分離目的基因、構(gòu)建工程菌（細(xì)胞）；主要在實(shí)驗(yàn)室完成；目的基因獲取后，要選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)→原核系統(tǒng)和真核系統(tǒng)。主要考慮的是要保證蛋白質(zhì)的功能，其次考慮的是表達(dá)量的多少和分離純化的難易下游階段：從工程菌（細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。包括:工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立、新型生物反應(yīng)器的研制、高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)、分離純化的優(yōu)化控制、高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)、生物傳感器的設(shè)計(jì)和制造。與傳統(tǒng)發(fā)酵不同，需對(duì)影響目的基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析三、獲得目的基因合成一段與目的DNA雙鏈的兩個(gè)3‘末端部分序列互補(bǔ)的、20余個(gè)堿基的寡核苷酸作為引物（primer）目的DNA變性后（單鏈模板），加入四種單核苷酸（dNTP）、引物和耐熱聚合酶。T↓，引物將與待擴(kuò)增的DNA鏈復(fù)性結(jié)合，在聚合酶的作用下，不斷延伸合成新互補(bǔ)鏈（1條DNA雙鏈→兩條）。變性（90-95℃）→復(fù)性（50-55℃）→引物延伸（60-72℃）的順序循環(huán)20至40個(gè)周期，就可以得到大量的DNA片段（可使DNA擴(kuò)增100余萬(wàn)倍）。PCR反應(yīng)特異性強(qiáng)，靈敏度高，極微量的DNA即可作為擴(kuò)增的模板得到大量的擴(kuò)增片段。1、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得基因來(lái)源于真核細(xì)胞的產(chǎn)生基因工程生化產(chǎn)品的目的基因，不能直接分離、克隆，Why？PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)引物時(shí)，可根據(jù)需要，在5‘延伸，添加限制酶識(shí)別序列及轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，或者利用堿基錯(cuò)配，對(duì)5’端密碼子進(jìn)行定點(diǎn)誘變，以改造翻譯起始區(qū)序列，提高基因表達(dá)效率2、從DNA文庫(kù)篩選基因1）制備基因文庫(kù)a.基因組文庫(kù)：由一種生物的基因組得到的DNA片段的集合，其中每個(gè)片段都連接到一個(gè)克隆載體上，該種生物的全部遺傳信息由文庫(kù)中的全部DNA片段代表。制備或選擇克隆載體→限制性酶局部消化基因組DNA→用蔗糖密度梯度離心法除去不適合克隆到選定載體中的片段→將基因組DNA片段和切開的載體DNA混合、連接→用連接物轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞（載體為質(zhì)粒）或體外包裝成噬菌體顆粒（載體為噬菌體）→得到含有不同重組DNA分子的基因組文庫(kù)b.cDNA文庫(kù)：只含有在一定生物或一定細(xì)胞和組織中表達(dá)的基因表達(dá)目的基因的細(xì)胞中提取總RNA，寡聚脫氧胸苷（dT）纖維素柱從總RNA中提取mRNA，以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA，再用DNA聚合酶合成cDNA的雙鏈，將產(chǎn)生的雙鏈cDNA片段插入到適當(dāng)?shù)妮d體中克隆RNA轉(zhuǎn)錄加工過(guò)程中，內(nèi)含子序列已被剪切掉，cDNA文庫(kù)適于在原核中表達(dá)，但cDNA只包含蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因部分，缺少有關(guān)的調(diào)控序列（需根據(jù)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)配以相應(yīng)的調(diào)控序列）真核生物基因中通常含有非編碼區(qū)及內(nèi)含子，在原核細(xì)胞宿主中不能正常表達(dá)，基因庫(kù)中的基因一般不能用于原核表達(dá)系統(tǒng)的基因工程2）DNA文庫(kù)中篩選目的基因每個(gè)基因都有唯一的核苷酸序列，利用與該基因互補(bǔ)的標(biāo)記DNA片段（探針）檢出目的基因探針可用放射性同位素標(biāo)記，也可用非放射性物質(zhì)如生物素、地高辛、熒光素等標(biāo)記作為探針的DNA片段，可為另一物種克隆的同源基因，也可為根據(jù)目的基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列和遺傳密碼知識(shí)設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸序列利用標(biāo)記DNA探針從DNA文庫(kù)中篩選目的基因的方法：1）硝酸纖維素膜或特制尼龍膜印在含有許多單菌落的瓊脂平板上（每個(gè)菌落都含有不同的重組DNA），每個(gè)菌落都有一些細(xì)胞黏在膜上，形成平板影印膜2）堿處理濾膜，變性后DNA仍留在原來(lái)菌落的位置3）標(biāo)記探針加到濾膜上，只與含有互補(bǔ)DNA序列的目的基因退火，使相應(yīng)菌落所在位置帶上標(biāo)記4）通過(guò)放射性自顯影顯現(xiàn)標(biāo)記的菌落（目的基因的克?。┰S多生長(zhǎng)因子的早期基因工程都是利用cDNA基因3、人工合成基因已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列或其基因的核苷酸序列，可利用DNA合成儀合成編碼該蛋白的基因現(xiàn)有DNA合成儀能力限制，先需分段合成目的基因的核苷酸序列，再將這些片段連接成完整基因可根據(jù)需要修改密碼子：采用宿主細(xì)胞偏愛(ài)的密碼子；在結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置添加轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列；在目的基因的兩側(cè)添加限制酶識(shí)別序列，以利于和載體的連接許多細(xì)胞生長(zhǎng)因子：胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、干擾素、EPO等都采用了人工合成基因4、載體的制備與連接表達(dá)載體除了具有一般克隆載體的特性外，還需有強(qiáng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子及翻譯調(diào)控序列如SD序列等表達(dá)載體的構(gòu)建或選擇由所用宿主類型和表達(dá)戰(zhàn)略兩因素決定不同的宿主有不同的表達(dá)載體；大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可采用直接表達(dá)、融合表達(dá)和分泌型表達(dá)三種不同戰(zhàn)略非融合表達(dá)載體：pBV220；pET系統(tǒng)；分泌型表達(dá)載體等（共有24種核酸內(nèi)切限制酶對(duì)pBR322DNA分子只具有單一識(shí)別位點(diǎn)。其中有9種限制酶其識(shí)別位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因區(qū)，還有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因（ampr）內(nèi)具有單一的識(shí)別位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)插入外源DNA則會(huì)導(dǎo)致ampr基因的失活→因DNA插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱為插入失活效應(yīng)。）具有較小的分子量(4361bp)具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)（每個(gè)細(xì)胞中可累積1000～3000個(gè)拷貝）具較高的拷貝數(shù)5、目的基因與載體連接根據(jù)目的基因和載體制備過(guò)程中產(chǎn)生的末端性質(zhì)不同，可采用黏性末端連接、平頭末端連接和人工接頭連接三種不同的連接策略6、轉(zhuǎn)化：細(xì)胞在一定生理狀態(tài)即感受態(tài)（competence）時(shí)，可攝取外源遺傳物質(zhì)，攝入的遺傳物質(zhì)可獨(dú)立復(fù)制或在體內(nèi)重組成為宿主細(xì)胞染色體的一部分，并帶給宿主細(xì)胞某些新的遺傳形狀→不同宿主需用不同的方法處理方法氯化鈣轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體-PEG轉(zhuǎn)化法電穿孔法適用范圍E.coli、葡萄球菌、其它G－枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、酵母菌微生物、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞DNA連接酶主要來(lái)自T4噬菌體和大腸桿菌DNA連接酶T4DNA連接酶催化粘性末端間的連接效率要比催化平末端連接效率高。大腸桿菌DNA連接酶不能催化DNA分子平端連接EcoRI的識(shí)別序列5‘-G_AATTC-3’3’-CTTAA_G-5’SmaI的識(shí)別序列5‘-CCC_TTT-3’3’-TTT_CCC-5’EcoRI的同尾酶MunI的識(shí)別序列是5'-C_AATTG–3‘3'-GTTAA_C–5'7、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定1）抗藥性篩選（質(zhì)粒載體幾乎都帶有某種抗藥性基因作為篩選標(biāo)記）→問(wèn)題：只要在抗生素平板上或培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的菌體一定為含有目的基因的重組菌嗎？2）單菌落快速電泳：抗藥性轉(zhuǎn)化子單菌落隨機(jī)挑出→快速提取質(zhì)?！娪緳z測(cè)→電泳結(jié)果判斷（比載體分子量大or小）？3）限制酶圖譜分析（對(duì)初步篩選的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞或質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析)4）Southern印跡雜交或菌落原位雜交：重組質(zhì)粒抽提→經(jīng)或不經(jīng)過(guò)酶切，瓊脂糖電泳→轉(zhuǎn)纖維素膜，標(biāo)記mRNA或cDNA為探針，Southern印跡雜交；也可不經(jīng)電泳，進(jìn)行菌落原位雜交5）基因及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定：測(cè)定核苷酸序列、通過(guò)免疫分析鑒定基因表達(dá)產(chǎn)物的存