農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究的方法學(xué)要素

農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究的方法學(xué)要素

對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)中殘留的農(nóng)藥，大多數(shù)人并不關(guān)心系統(tǒng)中多個(gè)環(huán)節(jié)的影響，而是整個(gè)系統(tǒng)的影響。鑒于生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和復(fù)雜性,農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)的許多研究成果所蘊(yùn)藏的生態(tài)學(xué)意義,往往需要在經(jīng)過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估之后方能得到揭示。正因?yàn)槿绱?農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)的研究?jī)?nèi)容和研究方法與農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系之間始終存在著相互依存、相互制約及相互促進(jìn)的關(guān)系。近20年來(lái),農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)本身有了較快的發(fā)展,相應(yīng)地,農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系也在不斷發(fā)展和完善。對(duì)于后者,近年來(lái)已有不少相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。在此,筆者擬主要從農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)的概念和方法學(xué)要素方面進(jìn)行闡述,以加深人們對(duì)該學(xué)科的認(rèn)識(shí)和理解。1農(nóng)藥環(huán)境毒性化的概念“生態(tài)毒理學(xué)(ecotoxicology)”一詞最早是由法國(guó)毒理學(xué)家RenéTruhaut提出的。Truhaut當(dāng)時(shí)給生態(tài)毒理學(xué)所下的定義為:“毒理學(xué)的一個(gè)分支,注重研究自然或人類(lèi)來(lái)源(人工合成)污染物對(duì)于作為生態(tài)系統(tǒng)組成部分的動(dòng)物(包括人類(lèi))、植物和微生物等的整體影響”。自從Truhaut給出該定義之后,不斷有學(xué)者提出了自己的觀點(diǎn)。具體可參見(jiàn)Connell等、Chapman、王德銘、孟紫強(qiáng)及Tarazona等的著述?；诟髯缘膶?zhuān)業(yè)背景,這些學(xué)者就生態(tài)毒理學(xué)給出了不同的解釋,這在一定程度上影響了人們對(duì)“農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)”內(nèi)涵和外延的界定。比照Truhaut的定義,可以認(rèn)為,農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)是研究農(nóng)藥及其有毒代謝產(chǎn)物對(duì)作為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)組成部分的非靶標(biāo)生物影響的一門(mén)學(xué)科。農(nóng)藥在野外的遷移和降解,其過(guò)程與室內(nèi)模擬條件下相似,因此可采用室內(nèi)的研究結(jié)果外推,但就效應(yīng)而言,則必須重視二者的區(qū)別。一個(gè)明顯的例子,現(xiàn)實(shí)生態(tài)系統(tǒng)如果受到農(nóng)藥的脅迫,隨著脅迫因子的減弱或消失,系統(tǒng)本身有可能恢復(fù),但這在室內(nèi)條件下幾乎不可能發(fā)生。在現(xiàn)實(shí)生態(tài)系統(tǒng)中,農(nóng)藥直接的作用對(duì)象雖然是個(gè)體,但該個(gè)體身處包含多個(gè)物種的群落之中,而群落與外界之間又保持著頻繁的物質(zhì)和能量交換,因此若想揭示農(nóng)藥在系統(tǒng)層面的危害效應(yīng),必須借助生態(tài)學(xué)的理論和方法。作為起源關(guān)系極為密切的2個(gè)學(xué)科,農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)和農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)在概念上存在交叉。其區(qū)別主要體現(xiàn)在:1)關(guān)注對(duì)象不同。對(duì)于非靶標(biāo)生物,農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)重點(diǎn)關(guān)注人類(lèi),而農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)則重點(diǎn)關(guān)注人類(lèi)以外的其他物種;在介質(zhì)方面,生態(tài)毒理學(xué)重點(diǎn)關(guān)注土壤、水/底泥系統(tǒng)以及大氣,而環(huán)境毒理學(xué)重點(diǎn)關(guān)注農(nóng)作物可食部分、飲用水以及人類(lèi)頻繁活動(dòng)的場(chǎng)所。2)關(guān)注層面不同。對(duì)于危害,農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)重點(diǎn)關(guān)注農(nóng)藥的群落和系統(tǒng)效應(yīng),即關(guān)注農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和完整性是否因?yàn)檗r(nóng)藥的使用而遭到損害;而農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)目前重點(diǎn)關(guān)注農(nóng)藥在個(gè)體及個(gè)體以下層面的危害效應(yīng)。3)學(xué)科歸屬不同。農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)從本質(zhì)上講屬于預(yù)防醫(yī)學(xué)的一個(gè)分支,而農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)在本質(zhì)上屬于生態(tài)學(xué)。4)成果的應(yīng)用領(lǐng)域不同。農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)的研究成果主要應(yīng)用于農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估;相應(yīng)地,農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)的研究成果主要應(yīng)用于農(nóng)藥健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。對(duì)于除人類(lèi)以外的非靶標(biāo)生物的關(guān)注以及提倡用生態(tài)學(xué)方法進(jìn)行研究,是農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)區(qū)別于農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)的明顯特征。在現(xiàn)實(shí)科研中,農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)家有時(shí)會(huì)以細(xì)胞、分子乃至基因?yàn)閷?duì)象來(lái)研究農(nóng)藥的毒害效應(yīng),而農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)家有時(shí)也會(huì)采用“流行病學(xué)”等研究方法。但值得注意的是,農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)家在從事流行病學(xué)調(diào)查時(shí),他們所關(guān)注的始終是被調(diào)查群體中的個(gè)體———人,而農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)家在研究細(xì)胞、分子乃至基因時(shí),他們其實(shí)并不關(guān)注農(nóng)藥在這些層面的毒害效應(yīng)本身,而是想進(jìn)一步了解這些毒害效應(yīng)與被暴露群體的生存狀況之間的關(guān)聯(lián)。2具體結(jié)果的確定農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究涉及面廣,內(nèi)容龐雜,因此只有突出重點(diǎn)、周密設(shè)計(jì)、嚴(yán)格實(shí)施,所得結(jié)果才有可能最大限度地滿足農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的客觀需求。以下將從不同角度對(duì)農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究的方法學(xué)要素加以探討。2.1測(cè)試周期按照歷期,農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)評(píng)估試驗(yàn)可分為“急性”、“亞急性(或稱“亞慢性”)”和“慢性”3種類(lèi)型。2.1.1急性試驗(yàn)的范疇急性試驗(yàn)用于檢測(cè)生物短期接觸高劑量農(nóng)藥后的中毒反應(yīng)。典型的急性試驗(yàn)是在一次性給藥的方式下進(jìn)行的,美國(guó)環(huán)保署(EPA)的“鳥(niǎo)類(lèi)急性口服試驗(yàn)”和“蜜蜂急性接觸試驗(yàn)”即屬于此類(lèi)型。而經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)的“蜜蜂急性經(jīng)口試驗(yàn)”和我國(guó)現(xiàn)行“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則”中的“赤眼蜂(成蜂)急性接觸試驗(yàn)”規(guī)定染毒時(shí)間為1h,均屬于不太典型的急性試驗(yàn)。急性試驗(yàn)要求受試生物在急性染毒后的觀察期要足夠長(zhǎng)。所謂足夠長(zhǎng),是指在該時(shí)段內(nèi),農(nóng)藥對(duì)受試生物的毒害效應(yīng)隨觀察期的延續(xù)而明顯增強(qiáng),超出這一時(shí)段,農(nóng)藥的毒害效應(yīng)則不再隨觀察期的延續(xù)而增強(qiáng)。在OECD頒布的“魚(yú)類(lèi)急性(96h)毒性試驗(yàn)”、“水蚤急性(48h)毒性試驗(yàn)”、“蚯蚓急性(14d)毒性試驗(yàn)”、“鳥(niǎo)類(lèi)(5d)飼喂毒性試驗(yàn)”、“藻類(lèi)(72h)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)”等試驗(yàn)中,受試生物接觸藥劑的時(shí)間與試驗(yàn)歷期相同,因此它們并非典型意義上的急性試驗(yàn)。之所以仍將其劃歸于急性試驗(yàn)的范疇,是因?yàn)樵谶@些試驗(yàn)中受試生物接觸藥劑的時(shí)間很短(通常只有1到數(shù)天),且該時(shí)間段只占受試生物整個(gè)生命歷期的很小一部分。除OECD“藻類(lèi)(72h)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)”這樣的以種群抑制率為測(cè)試終點(diǎn)的試驗(yàn)外,急性試驗(yàn)通常以死亡率作為測(cè)試終點(diǎn)。2.1.2魚(yú)類(lèi)毒性試驗(yàn)亞急性試驗(yàn)是在持續(xù)脅迫或重復(fù)給藥的方式下進(jìn)行的,此類(lèi)試驗(yàn)的歷期明顯長(zhǎng)于急性試驗(yàn),如OECD的“魚(yú)類(lèi)長(zhǎng)期(14d)毒性試驗(yàn)”,EPA的“蚯蚓亞慢性(28d)毒性試驗(yàn)”等。雖然死亡率仍是常用的測(cè)試終點(diǎn),但體長(zhǎng)、體重等個(gè)體指標(biāo)在此類(lèi)試驗(yàn)中受到了更多的關(guān)注。2.1.3急性試驗(yàn)與個(gè)體指標(biāo)慢性試驗(yàn)是為衡量生物長(zhǎng)期暴露于低劑量化學(xué)品中所受的毒害而設(shè)立的,其歷期通常涵蓋受試生物生活史的大部分時(shí)間或者整個(gè)世代,如EPA和OECD的“溞類(lèi)(21d)繁殖毒性試驗(yàn)”、OECD的“搖蚊沉積物毒性試驗(yàn)”等。相對(duì)于急性試驗(yàn)中的死亡率,慢性試驗(yàn)更側(cè)重于關(guān)注受試生物的體長(zhǎng)、體重等個(gè)體指標(biāo),以及生殖率、種群內(nèi)稟增長(zhǎng)率等群體指標(biāo)。將急性試驗(yàn)的結(jié)果與農(nóng)藥在環(huán)境中的短期沉積量相比較,可以得知農(nóng)藥對(duì)環(huán)境生物的急性風(fēng)險(xiǎn)(acuterisk);相應(yīng)地,將亞急性或慢性的試驗(yàn)結(jié)果與農(nóng)藥在環(huán)境中的長(zhǎng)期沉積量相比較,可得知農(nóng)藥對(duì)環(huán)境生物的長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)(chronicrisk)。2.2采用客觀劑量法進(jìn)行試驗(yàn)農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)評(píng)估試驗(yàn)的劑量(或濃度)設(shè)置方案主要有2種,即考慮或不考慮農(nóng)藥的環(huán)境沉積量,前者可稱之為“主觀劑量法”,后者可稱作“客觀劑量法”。所謂主觀劑量法,即試驗(yàn)劑量(或濃度)是由研究者主觀確定的。采用該方法開(kāi)展試驗(yàn)時(shí),其目的在于建立劑量-效應(yīng)方程,再根據(jù)所建立的方程求得x%效應(yīng)值(EDx)或x%效應(yīng)濃度(ECx),或者通過(guò)各處理組之間或處理組與對(duì)照組之間的差異顯著性分析,求得受試物的最高無(wú)作用劑量/最低有效劑量(NOED/LOED)或最高無(wú)作用濃度/最低效應(yīng)濃度(NOEC/LOEC),進(jìn)而確定受試物的最大允許劑量(maximalallowabletoxicantdosage,MATD)或最大允許濃度(maximalallowabletoxicantconcentration,MATC)。需要指出的是,采用主觀劑量法的試驗(yàn),因其以建立劑量-效應(yīng)方程、求取效應(yīng)中值(ED50)或效應(yīng)中濃度(EC50)為目的,所以判斷試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理與否,要看所設(shè)劑量下的效應(yīng)變化能否滿足回歸分析的需要。至于各劑量組(包括對(duì)照組)內(nèi)部是否需要設(shè)置重復(fù)以及需設(shè)置多少個(gè)重復(fù),在此并非重點(diǎn)(測(cè)試終點(diǎn)為數(shù)量型結(jié)果的例外,因?yàn)檫@些試驗(yàn)中每一劑量組的數(shù)據(jù)均需要與對(duì)照組比對(duì),因而此時(shí)的對(duì)照組宜多設(shè)重復(fù));相反,如果試驗(yàn)以求取MATD或MATC為目的,則各劑量組(包括對(duì)照組)內(nèi)部不僅必須設(shè)置重復(fù),而且重復(fù)次數(shù)需達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn),以滿足差異顯著性分析的需要。采用客觀劑量法開(kāi)展試驗(yàn)時(shí),研究者以農(nóng)藥的田間沉積量(或沉積濃度)作為劑量選擇的依據(jù)。天敵和土壤微生物是較多采用客觀劑量法進(jìn)行測(cè)試的生物類(lèi)群。以田間沉積量(或沉積濃度)作為試驗(yàn)劑量的選擇依據(jù),從理論上講,其結(jié)果可以直觀顯示受試農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。然而該方法也具有局限性:首先,農(nóng)藥田間沉積量預(yù)測(cè)結(jié)果本身即存在一定的誤差;其次,即便選定的劑量能夠真實(shí)反映農(nóng)藥的田間沉積量,其所反映的也僅是某一位點(diǎn)和某一時(shí)刻的沉積量。一旦處理組的效應(yīng)與對(duì)照組差異不明顯,人們將無(wú)從推斷受試農(nóng)藥在更高劑量下可能產(chǎn)生的影響?？梢?jiàn)從風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的角度,客觀劑量法的試驗(yàn)結(jié)果并不具有更高的利用價(jià)值,相反,將通過(guò)主觀測(cè)量法測(cè)得的有害劑量(ECx、NOEC/LOEC等)與暴露數(shù)據(jù)相對(duì)照,不但能夠判斷相關(guān)農(nóng)藥在某一時(shí)空節(jié)點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)大小,而且能夠給出這種風(fēng)險(xiǎn)的時(shí)間和空間分布。2.3試驗(yàn)的可控性按照試驗(yàn)的可控性,農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)評(píng)估試驗(yàn)大致可分為“室內(nèi)”、“半田間”和“田間”3個(gè)層次。2.3.1人工土為主的受試物種室內(nèi)試驗(yàn)要求在相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境條件下進(jìn)行。例如“OECD化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則”判斷魚(yú)類(lèi)和溞類(lèi)試驗(yàn)結(jié)果是否有效的前提之一,就是稀釋液中的溶解氧含量在試驗(yàn)過(guò)程中能否保持在其飽和值的60%以上,為了滿足這一條件,有時(shí)需要周期性地更換稀釋液,甚至可能需要在“流水”條件下進(jìn)行試驗(yàn)。再如土壤微生物試驗(yàn),“OECD化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則”規(guī)定土壤含水量應(yīng)控制在最大持水量的40%~60%之間,相應(yīng)地,美國(guó)EPA“生態(tài)效應(yīng)測(cè)試準(zhǔn)則OPPTS850.5100”對(duì)于土壤含水量的規(guī)定值為10kPa左右。環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)化是人們對(duì)室內(nèi)試驗(yàn)的一項(xiàng)基本要求。天然土壤由于理化性質(zhì)各異,導(dǎo)致農(nóng)藥在其中的有效性(availability)不同,因而有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性,為此,除微生物試驗(yàn)外,原本以土壤為基質(zhì)的試驗(yàn),目前大多以人工土代替。室內(nèi)生物試驗(yàn)中所用的受試物種通常要求具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和/或生態(tài)價(jià)值,材料易得,并具有較強(qiáng)的生命力。我國(guó)現(xiàn)行“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則”推薦鯉魚(yú)Cyprinuscarpio和斑馬魚(yú)Brachydoniorerio作為魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)的代表物種。鯉魚(yú)在我國(guó)各地均有分布,又是重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi),因此我國(guó)選用鯉魚(yú)的理由跟歐美國(guó)家選用虹鱒魚(yú)Oncorhynchusmykiss和太陽(yáng)魚(yú)Lepomiscyanellus完全一致;斑馬魚(yú)是一種小型的熱帶觀賞魚(yú),其在我國(guó)境內(nèi)并沒(méi)有自然分布,更談不上所謂經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值,但該魚(yú)室內(nèi)生命力強(qiáng),易于繁殖,因而同樣成為了常用的受試物種;以同樣原因入選的受試物種還有非洲爪蟾Xenopuslaevis、赤子愛(ài)勝蚓Eiseniafoetida等。相反,在我國(guó)分布廣且具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的“四大家魚(yú)”(青魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)、鳙魚(yú))卻很少被選作毒性試驗(yàn)的受試物種,其原因則是由于這些魚(yú)類(lèi)的幼體很難適應(yīng)室內(nèi)飼養(yǎng)。雖然室內(nèi)試驗(yàn)的對(duì)象以單物種居多,但也有例外。在檢測(cè)化學(xué)品對(duì)土壤微生物碳轉(zhuǎn)化和氮轉(zhuǎn)化影響的試驗(yàn)中,作為介質(zhì)的土壤中包含了多種微生物,因此此類(lèi)試驗(yàn)在本質(zhì)上屬于小型微宇宙試驗(yàn)。類(lèi)似的還有美國(guó)測(cè)試和材料學(xué)會(huì)(ASTM)頒布的“標(biāo)準(zhǔn)化水生微宇宙(standardaquaticmicrocosm,SAM)試驗(yàn)”。室內(nèi)試驗(yàn)所能采用的給藥方式不可避免地會(huì)受到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系的影響。以家蠶為例,從技術(shù)的角度,可采用的給藥方式包括“浸葉”、“浸蟲(chóng)”、“點(diǎn)滴”、“拌葉”、“定量噴霧”等,但從風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的角度考慮,只有定量噴霧法和拌葉法的測(cè)定結(jié)果能夠與現(xiàn)有評(píng)估體系較好地銜接,因此應(yīng)優(yōu)先采用。當(dāng)可選的給藥方式不止1種時(shí),應(yīng)以評(píng)估目標(biāo)作為選擇的向?qū)?。如?duì)于非靶標(biāo)植物,可用的給藥方式有“水培”、“土培”、“葉面噴霧”等,但對(duì)于莖葉處理劑,如除草劑草甘膦等,則只有葉面噴霧法的測(cè)定結(jié)果能夠?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供有價(jià)值的信息,采用其他給藥方式所得的測(cè)量結(jié)果很可能使評(píng)估結(jié)論出現(xiàn)偏差。2.3.2田間試驗(yàn)在農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的作用以室內(nèi)試驗(yàn),特別是單物種室內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)推測(cè)農(nóng)藥對(duì)農(nóng)田及周邊區(qū)域的生態(tài)效應(yīng),其結(jié)果的可靠性往往受到質(zhì)疑。這主要是因?yàn)?1)野外環(huán)境條件,如溫度、濕度、光照等的晝夜和季節(jié)性變化,以及農(nóng)藥野外殘留的時(shí)空變化等在室內(nèi)條件下很難準(zhǔn)確模擬。2)農(nóng)藥的諸多效應(yīng),如間接毒性、二次毒性、趨避作用等,在室內(nèi)條件下很難被準(zhǔn)確測(cè)量。3)在室內(nèi)條件下,人們很難觀測(cè)到被暴露系統(tǒng)的恢復(fù)情況。鑒于室內(nèi)試驗(yàn)在預(yù)測(cè)農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)方面的局限性,當(dāng)存在爭(zhēng)議時(shí),田間試驗(yàn)就成為了人們否認(rèn)(或者確認(rèn))農(nóng)藥產(chǎn)品生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的最終依據(jù)。圖1形象地展示了田間試驗(yàn)在農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的地位和作用。從圖1可看出,田間試驗(yàn)的作用主要體現(xiàn)在:1)為(暴露)模型提供來(lái)自田間的驗(yàn)證數(shù)據(jù)。2)最終否認(rèn)(或確認(rèn))農(nóng)藥產(chǎn)品的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。3)為農(nóng)藥的“登記后評(píng)估”提供數(shù)據(jù)。田間試驗(yàn)雖然能夠較為真實(shí)地反映農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn),但通常存在花費(fèi)昂貴、試驗(yàn)周期長(zhǎng)、可控程度低、結(jié)果重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)。鑒于此,人們又設(shè)計(jì)出一系列相當(dāng)于中間環(huán)節(jié)的試驗(yàn)系統(tǒng),即“半田間試驗(yàn)”系統(tǒng)。根據(jù)所占空間的大小,半田間試驗(yàn)系統(tǒng)可進(jìn)一步被劃分為“微宇宙(microcosms)”、“中宇宙(mesocosms)”及“大宇宙(macrocosms)”,其共同特點(diǎn)是既可在一定程度上保留生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能,又允許人們對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行一定程度的操控。至于微宇宙、中宇宙和大宇宙的具體規(guī)格劃分,目前學(xué)界尚無(wú)定論。對(duì)水生生物而言,Heimbach認(rèn)為:小于0.1m3的,只能算作“燒杯”;0.1~1m3的,可算作“水族箱”;1~15m3的,可視為微宇宙;而可以被稱作中宇宙的,應(yīng)該是體積大于15m3的水生生態(tài)系統(tǒng)。從生物結(jié)構(gòu)上,上述半田間試驗(yàn)系統(tǒng)又可劃分為“靜水(lentic)”和“流水(lotic)”兩大類(lèi)。其中靜水系統(tǒng)可以再區(qū)分為以維管植物為主要能量來(lái)源、物種構(gòu)成比較復(fù)雜的“淺水系統(tǒng)”和以浮游植物為主要能量來(lái)源、物種構(gòu)成比較簡(jiǎn)單的“深水系統(tǒng)”。需要特別指出的是,淺水系統(tǒng)所代表的池塘沿岸和排水溝渠是較容易受到農(nóng)藥污染的區(qū)域,故應(yīng)得到農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)家的重點(diǎn)關(guān)注。2.3.3對(duì)受試生物的選擇從經(jīng)濟(jì)和時(shí)效性的角度,為評(píng)估農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)而開(kāi)展的試驗(yàn)應(yīng)遵從先急性后慢性,先室內(nèi)后田間的順序。如果室內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果能夠明確否認(rèn)受試農(nóng)藥的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn),整個(gè)試驗(yàn)即可終止;相反,如果室內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果顯示受試農(nóng)藥具有風(fēng)險(xiǎn),要明確這種風(fēng)險(xiǎn)是否真會(huì)在田間發(fā)生,則需進(jìn)一步開(kāi)展半田間甚至田間試驗(yàn)。為避免在試驗(yàn)的任何層次上出現(xiàn)假陰性結(jié)果,試驗(yàn)設(shè)計(jì)者應(yīng)該確保受試生物在室內(nèi)試驗(yàn)中所受的脅迫強(qiáng)度高于半田間或田間試驗(yàn)。例如“OECD化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則”中的“魚(yú)類(lèi)急性(96h)毒性試驗(yàn)”,其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一就是在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中,受試藥劑在稀釋液中的實(shí)際濃度始終不低于理論添加濃度的20%。又如“OECD化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則”之“土壤微生物氮轉(zhuǎn)化試驗(yàn)”和“土壤微生物碳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)”給土壤微生物群落設(shè)定了一個(gè)代表“最差狀況(worstcasesituation)”的基質(zhì)條件,預(yù)期化學(xué)品在此基質(zhì)中的有效性最高且降解率最低,如果在以該基質(zhì)配制的毒土中測(cè)得農(nóng)藥對(duì)土壤微生物碳轉(zhuǎn)化或氮轉(zhuǎn)化的抑制作用不明顯,就無(wú)需再用其他基質(zhì)進(jìn)行測(cè)試。同樣是出于避免假陰性結(jié)果的考慮,在受試生物的選擇上,生態(tài)毒理學(xué)家在室內(nèi)試驗(yàn)中傾向采用處于生理敏感期的生物個(gè)體,如出生后6~24h的幼溞、蛙類(lèi)蝌蚪、2齡起家蠶(其大小可確保癥狀觀察能夠順利進(jìn)行)、羽化赤眼蜂等。這與在室內(nèi)藥效試驗(yàn)中傾向采用非敏感個(gè)體(如末齡幼蟲(chóng))的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)學(xué)家的做法有所不同。2.4模型預(yù)測(cè)法開(kāi)展暴露評(píng)估的目的在于確定農(nóng)藥在環(huán)境介質(zhì)中的沉積量及沉積范圍。方法主要有2種:實(shí)地測(cè)量和模型預(yù)測(cè)。表1為農(nóng)藥初始?xì)埩舴植嫉膶?shí)地測(cè)量數(shù)據(jù)(測(cè)量時(shí)的氣溫為25℃,風(fēng)速5m/s)?；谶@些數(shù)據(jù),人們可以推算出藥劑在不同作物農(nóng)田周?chē)某练e量和沉積范圍。模型預(yù)測(cè)是確定農(nóng)藥沉積量和沉積范圍的另一種常用方法。人們針對(duì)特定場(chǎng)景(scenario)開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的預(yù)測(cè)模型,如預(yù)測(cè)農(nóng)藥在水體中沉積量的GENEEC和EXAMS,預(yù)測(cè)農(nóng)藥在旱地沉積量的T-REX和TIM,以及可預(yù)測(cè)農(nóng)藥在大氣中含量的AgDRIFTue5f8和AgDISP等。在運(yùn)用上述模型時(shí),人們首先需要了解相關(guān)農(nóng)藥的使用方式和使用量,此外還需了解該農(nóng)藥的理化性質(zhì)和環(huán)境行為等信息(表2)。其中涉及農(nóng)藥環(huán)境行為的信息既可來(lái)自室內(nèi)試驗(yàn),也可來(lái)自半田間或田間試驗(yàn),但在大多數(shù)情況下其來(lái)自于室內(nèi)試驗(yàn)。2.5衡量尺度的統(tǒng)一將農(nóng)藥暴露水平與其有害劑量相比對(duì),即可獲得該農(nóng)藥對(duì)于非靶標(biāo)生物的“風(fēng)險(xiǎn)商值(riskquotient,RQ)”。RQ屬于無(wú)單位量綱。作為RQ的決定因子,暴露水平和有害劑量在衡量尺度上應(yīng)該一致,而基于化學(xué)分析的“實(shí)測(cè)濃度(actualconcentrations)”正是提供了這樣一種衡量尺度。因此從理論上講,有害劑量通常應(yīng)該以實(shí)測(cè)濃度來(lái)衡量;至于“名義濃度(nominalconcentrations)”,只有當(dāng)有證據(jù)表明其與實(shí)測(cè)濃度高度吻合(吻合度達(dá)到80%)時(shí),才可取代后者而參與有害劑量的確定,進(jìn)而參與RQ的求取。由此可見(jiàn),從風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的角度,在進(jìn)行毒性試驗(yàn)的過(guò)程中總是應(yīng)該同步測(cè)量各處理組的農(nóng)藥含量,以求得基于實(shí)測(cè)濃度的ECx或MATC。2.6追溯性研究retrospityfora在農(nóng)藥產(chǎn)品登記之前開(kāi)展的研究,可以稱之為“預(yù)測(cè)性研究(prospectivestudies)”,旨在明確農(nóng)藥產(chǎn)品入市之后可能造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn);針對(duì)已經(jīng)獲得登記的農(nóng)藥產(chǎn)品而開(kāi)展的研究,應(yīng)該稱之為“追溯性研究(retrospectivestudies)”。盡管生態(tài)毒理學(xué)的研究方法和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系均在不斷改進(jìn)和完善,但鑒于生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和復(fù)雜性,任何管理部門(mén)和研究機(jī)構(gòu)都不能確保已通過(guò)評(píng)估程序并獲得登記的農(nóng)藥產(chǎn)品在實(shí)際使用中不會(huì)對(duì)農(nóng)田及周邊區(qū)域造成不良影響,因此有必要開(kāi)展追溯性研究。不僅如此,有一些農(nóng)藥產(chǎn)品在預(yù)測(cè)性研究中即被認(rèn)為具有某種程度的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn),但經(jīng)過(guò)風(fēng)險(xiǎn)-效益評(píng)估,在附加了限制條件之后被允許進(jìn)入市場(chǎng),至于這些限制是否合理,是否需要進(jìn)行修改,要回答諸如此類(lèi)的問(wèn)題,也需要開(kāi)展追溯性研究。追溯性研究的結(jié)果仍有可能對(duì)評(píng)估結(jié)論產(chǎn)生重大影響。2.7he和alad在包括農(nóng)藥在內(nèi)的化學(xué)污染物的脅迫下,生命有機(jī)體的生理和生化過(guò)程會(huì)發(fā)生改變,這些改變可通過(guò)組織學(xué)和形態(tài)學(xué)等特征表現(xiàn)出來(lái),甚至影響到物種的行為和生存。因此從理論上講,任何與生命活動(dòng)有關(guān)的生理和生化過(guò)程,包括相關(guān)的組織學(xué)、形態(tài)學(xué)特征,只要易受污染物的影響而發(fā)生變化,均有可能成為生態(tài)毒理學(xué)研究的“生物標(biāo)志物(biomarkers)”。在眾多生物標(biāo)志物中,應(yīng)用最廣的當(dāng)數(shù)來(lái)自動(dòng)物腦和血清中的膽堿酯酶(cholinesterase,ChE)。從應(yīng)用的角度,生態(tài)毒理學(xué)研究所選用的標(biāo)志物應(yīng)該具有較高的靈敏度和適當(dāng)?shù)奶禺愋?。以氨基乙酰丙酸脫水?aminolevulinatedehydratase,ALAD)為例,由于該酶對(duì)鉛十分敏感,若水禽血液中ALAD活性下降,則無(wú)需進(jìn)一步測(cè)定即可斷定水禽血液中鉛的含量達(dá)到了一定水平。同樣,當(dāng)水生和陸生動(dòng)物腦和血清中ChE活性下降時(shí),說(shuō)明動(dòng)物機(jī)體受到了有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的污染。就特異性而言,ChE不如ALAD,因?yàn)橐肱袛辔廴驹淳烤箒?lái)自何種有機(jī)磷或氨基甲酸酯,仍需要對(duì)樣品進(jìn)行化學(xué)分析。需要指出的是,生物標(biāo)志物的特異性并非越高越好,比如ALAD,其特異性雖高,但是對(duì)ALAD的測(cè)定結(jié)果并不能提供有關(guān)其他污染物的任何信息。除了顯示環(huán)境中污染物的存在之外,生態(tài)毒理學(xué)家還希望標(biāo)志物能夠顯示污染物的毒害效應(yīng),即具有預(yù)警功能。在儀器分析手段已日益完善的今天,生物標(biāo)志物之所以仍然能夠吸引研究者的關(guān)注,其原因正在于此。例如在溞類(lèi)的研究中,人們已經(jīng)將注意力放在ChE活性變化與被暴露群體生物量變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系上。需要指出的是,生物標(biāo)志物的反應(yīng)與污染物有害效應(yīng)之間是否存在對(duì)應(yīng)關(guān)系,以及究竟存在何種對(duì)應(yīng)關(guān)系,要視標(biāo)志物和污染物的種類(lèi)和性質(zhì)而定。這方面尚有許多問(wèn)題等待人們?nèi)ヌ骄?。開(kāi)展農(nóng)藥生態(tài)效應(yīng)評(píng)估試驗(yàn),往往需要大量收集物種及其生物量方面的信息。此類(lèi)信息有時(shí)可以通過(guò)對(duì)諸如磷脂脂肪酸、幾丁質(zhì)酶等標(biāo)志物的測(cè)定而獲得。充分利用這類(lèi)標(biāo)志物,可以在一定程度上減少因?yàn)槿蛹皹悠疯b定所造成的誤差。3glp體系的形成除上文已提到的主要方法學(xué)要素之外,另有一些要素,如良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范(GLP)、試驗(yàn)準(zhǔn)則、動(dòng)物福利等,從概念上講它們并不專(zhuān)屬于農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué),但是這些要素深刻影響著該學(xué)科的研究?jī)?nèi)容和研究方法,故在此一并加以探討。GLP的最初建立被認(rèn)為與20世紀(jì)70年代發(fā)生在美國(guó)的涉及藥品和化學(xué)品(主要是農(nóng)藥)的一系列動(dòng)物試驗(yàn)詐騙案件有關(guān)。1979年,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)頒布了世界上第一個(gè)GLP法規(guī);1980年,美國(guó)EPA頒布了有關(guān)農(nóng)藥的GLP法規(guī);1981年,以美國(guó)FDA的GLP法規(guī)為藍(lán)本,OECD推出了涵蓋所有化合物的GLP法規(guī)。我國(guó)GLP建設(shè)首先是從醫(yī)藥領(lǐng)域開(kāi)始的,農(nóng)藥行業(yè)的GLP建設(shè)始于2002年,此后農(nóng)業(yè)部陸續(xù)制訂了涉及農(nóng)藥理化性質(zhì)、殘留、毒理和環(huán)境毒理的GLP準(zhǔn)則,并于2010年5月公告了沈陽(yáng)化工研究院安全評(píng)價(jià)中心等6家農(nóng)藥GLP實(shí)驗(yàn)室。建立GLP的目的在于加強(qiáng)對(duì)試驗(yàn)機(jī)構(gòu)及試驗(yàn)操作的管理。按照GLP的要求開(kāi)展試驗(yàn),其相關(guān)的一切過(guò)程,包括人員任命、培訓(xùn)、樣品接收、試驗(yàn)方案制定、試驗(yàn)操作、樣品采集、儀器使用、試驗(yàn)結(jié)果記錄、質(zhì)量核查、資料保存等均需要加以“文件化”,以便自查和外部核查。基于上述原因,GLP體系下形成的數(shù)據(jù)在真實(shí)性方面具有比較可靠的保障。對(duì)于農(nóng)藥,在涉及質(zhì)量、藥效、健康風(fēng)險(xiǎn)及環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的各項(xiàng)試驗(yàn)中,產(chǎn)品質(zhì)量和藥效試驗(yàn)較多關(guān)乎生產(chǎn)商的經(jīng)濟(jì)利益,而健康風(fēng)險(xiǎn)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)試驗(yàn)較多關(guān)乎公眾利益,為確保試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性,有必要將這2類(lèi)試驗(yàn)過(guò)程置于GLP的管控之下。對(duì)于一些探索性的課題,例如確認(rèn)化學(xué)品的某種未知危害方式或作用機(jī)理等時(shí),出于知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)或其他類(lèi)似原因,研究者不愿公布其研究過(guò)程或研究方法的細(xì)節(jié),這在學(xué)術(shù)界并非不可接受,但這種做法與GLP所倡導(dǎo)的“公開(kāi)性”原則相沖突,所以在對(duì)于非GLP數(shù)據(jù)的選用上,風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估人員往往持謹(jǐn)慎態(tài)度,在同等條件下,他們會(huì)優(yōu)先選用GLP體系下的數(shù)據(jù)。3.2環(huán)境試驗(yàn)的主要內(nèi)容人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)到,方法上的細(xì)微差別會(huì)對(duì)測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生明顯影響。例如在測(cè)定農(nóng)藥對(duì)魚(yú)的急性毒性時(shí),供試魚(yú)的齡期、試驗(yàn)溫度、暴露時(shí)間(48h或96h)、稀釋水的水質(zhì)等均會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。又如薄層層析試驗(yàn)中,因土層厚度不同,農(nóng)藥在其上的移動(dòng)性也會(huì)有所不同。為此有必要對(duì)測(cè)試方法加以規(guī)范,以保證不同實(shí)驗(yàn)室的不同人員在不同時(shí)刻開(kāi)展試驗(yàn),均能夠得出相同或相近的結(jié)果?？梢?jiàn),制訂各類(lèi)試驗(yàn)準(zhǔn)則的目的之一是確保試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性。目前OECD所制定的化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則中均包含了對(duì)試驗(yàn)本身的質(zhì)量要求。例如“溞類(lèi)(21d)繁殖毒性試驗(yàn)”,其質(zhì)量要求之一是在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組每一雌性個(gè)體的平均繁殖量≥60;又如“藻類(lèi)(72h)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)”,其質(zhì)量要求之一是在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組的細(xì)胞密度≥試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的16倍。這些要求若得到滿足,相關(guān)試驗(yàn)才被認(rèn)為是合格的。從1981年起,OECD陸續(xù)頒布了一系列“化學(xué)品測(cè)試準(zhǔn)則”。這些準(zhǔn)則共包含5個(gè)系列:1)理化特性(physicalchemicalproperties);2)生物效應(yīng)(effectsonbioticsystems);3)降解和蓄積(degradationandaccumulation);4)健康效應(yīng)(healtheffects);5)其他(主要涉及農(nóng)藥殘留)。截至2013年7月,生物效應(yīng)系列中共收錄了涉及19種(類(lèi))生物的35項(xiàng)(急、慢性)試驗(yàn)準(zhǔn)則;降解和蓄積系列中共收錄了涉及生物富積、土壤和水/沉積物(好氧和厭氧)轉(zhuǎn)化、(土)柱淋溶以及(水中)光轉(zhuǎn)化的7項(xiàng)試驗(yàn)準(zhǔn)則;而有關(guān)水解和土壤吸附的試驗(yàn)準(zhǔn)則被收錄在系列1(理化特性)中。這些準(zhǔn)則基本涵蓋了涉及農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的各項(xiàng)室內(nèi)試驗(yàn)。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)于1979年召開(kāi)了有關(guān)農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估程序和資料要求的專(zhuān)家咨詢會(huì)議,并于1981年頒布了有關(guān)“農(nóng)藥登記環(huán)境試驗(yàn)”的若干準(zhǔn)則(即:secondexpertconsultationonenvironmentalcriteriaforregistrationofpesticides)。1989年,FAO又對(duì)該準(zhǔn)則做了修訂,最終將農(nóng)藥登記的環(huán)境試驗(yàn)分為3部分:1)理化性質(zhì)(physico-chemicalproperties);2)歸趨和移動(dòng)(fateandmobilityinenvironment);3)環(huán)境效應(yīng)(effectsonenvironment)。美國(guó)EPA的“化學(xué)安全和污染防治辦公室(OCSPP)”自1996年起陸續(xù)制訂了11個(gè)系列的試驗(yàn)準(zhǔn)則,即“OPPTS(theofficeofprevention,pesticidesandtoxicsubstances)測(cè)試準(zhǔn)則”。其中與農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估相關(guān)的試驗(yàn)準(zhǔn)則分別被收錄在“OPPTS835”、“OPPTS840”和“OPPTS850”之中。OPPTS835收錄了涉及“歸趨(fate)”、“遷移(transport)”和“轉(zhuǎn)化(transformation)”方面的試驗(yàn)準(zhǔn)則;OPPTS840收錄了涉及“噴霧漂移(spraydrift)”的試驗(yàn)準(zhǔn)則;有關(guān)“生態(tài)效應(yīng)(ecologicaleffects)”的試驗(yàn)準(zhǔn)則被收錄在了OPPTS850之中。我國(guó)有關(guān)農(nóng)藥環(huán)境行為和生態(tài)毒性試驗(yàn)的“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則”最初由南京環(huán)境科學(xué)研究所負(fù)責(zé)起草,經(jīng)全國(guó)農(nóng)藥登記評(píng)審委員會(huì)討論通過(guò)后,由國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局于1989年頒布。該準(zhǔn)則由“農(nóng)藥對(duì)環(huán)境安全性影響因素”、“農(nóng)藥環(huán)境安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)與評(píng)價(jià)試驗(yàn)程序”和“農(nóng)藥對(duì)環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則”3部分組成,重點(diǎn)是第3部分。在該部分中,農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)被分為2類(lèi):“農(nóng)藥環(huán)境行為特征評(píng)價(jià)試驗(yàn)”和“農(nóng)藥對(duì)非靶生物毒性試驗(yàn)”,每一類(lèi)分別包含10項(xiàng)試驗(yàn)。以蔡道基院士為首的課題組于20世紀(jì)80年代中后期開(kāi)展的一系列研究[58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73]為該準(zhǔn)則的起草奠定了基礎(chǔ)。自2004年我國(guó)第一批農(nóng)藥登記環(huán)境毒理試驗(yàn)單位獲得認(rèn)證后,農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所多次組織有關(guān)專(zhuān)家對(duì)該準(zhǔn)則進(jìn)行補(bǔ)充和修訂,修訂后的“化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則”共包含農(nóng)藥環(huán)境行為特征評(píng)價(jià)試驗(yàn)8項(xiàng),農(nóng)藥對(duì)非靶生物毒性試驗(yàn)13項(xiàng)。隨著人們認(rèn)識(shí)的深化和提高,涉及農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)研究的新的試驗(yàn)準(zhǔn)則還將不斷建立,舊的準(zhǔn)則也會(huì)在修訂中不斷完善。但是,試驗(yàn)準(zhǔn)則的建立當(dāng)前是、將來(lái)也主要是為了解決生態(tài)毒理學(xué)研究中一些具有共性的科學(xué)問(wèn)題,在對(duì)農(nóng)藥等化學(xué)品開(kāi)展生態(tài)毒理學(xué)研究的過(guò)程中,人們會(huì)不斷遇到各種特殊的具體問(wèn)題,為解答這些特殊問(wèn)題而開(kāi)展的研究,現(xiàn)在沒(méi)有、將來(lái)也不一定有相關(guān)的試驗(yàn)準(zhǔn)則可供依賴。3.3oecd對(duì)減少原則的繼受所謂“動(dòng)物福利”,即要求人們從生理和心理上善待動(dòng)物。早在1959年,Russell和Burch在其著作《TheP