瓜葉菊‘小徑’系列花色品種培養(yǎng)基的篩選

瓜葉菊‘小徑’系列花色品種培養(yǎng)基的篩選

瓜葉菊是薔薇科植物種類(lèi)的觀賞價(jià)值很高的多年生花卉?；ㄆ跒槎酒贩N（12月至次年4月）。植株繁茂，花朵繁茂，覆蓋著整個(gè)植物。色彩豐富多變，再現(xiàn)出溫暖的氣氛。這是一個(gè)重要的節(jié)日花卉，具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。瓜葉菊主要通過(guò)種子繁殖。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)中使用的種子均為進(jìn)口,價(jià)格昂貴,種子繁殖系數(shù)很低,難以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求,限制了其產(chǎn)業(yè)化和商品化生產(chǎn)。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行離體快繁,是快速獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗的有效途徑。目前國(guó)外對(duì)瓜葉菊的研究多數(shù)集中在栽培、起源、單基因的分離及功能分析等方面,關(guān)于瓜葉菊不同品系離體快繁的相關(guān)報(bào)道極少。瓜葉菊全株密披絨毛,莖桿粗短,滅菌難度大且材料來(lái)源相對(duì)較少,給再生體系的建立帶來(lái)了一定的困難。Iizuka等在1973年利用瓜葉菊的管狀花誘導(dǎo)出了愈傷組織,這是對(duì)瓜葉菊試管繁殖的最早嘗試,但未能建立其穩(wěn)定的再生體系。國(guó)內(nèi)研究者曾利用莖段、葉片、葉柄、花梗和花托為外植體獲得了再生植株,但未見(jiàn)移栽試驗(yàn)后關(guān)于再生植株開(kāi)花的后續(xù)報(bào)道。何少波等利用瓜葉菊的幼葉和葉柄作為外植體,發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)率極低,分別為10%和0。本研究首次采用瓜葉菊的種子為外植體直接獲得無(wú)菌苗,進(jìn)而通過(guò)研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和濃度組合的作用,探索適于瓜葉菊組培苗不同部位器官離體再生的優(yōu)化培養(yǎng)基,建立瓜葉菊試管苗組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系和植株再生體系,并對(duì)不同種子建立的株系花色穩(wěn)定性進(jìn)行觀察和分析。這一研究對(duì)瓜葉菊種質(zhì)資源的保護(hù)、開(kāi)發(fā)利用和開(kāi)展分子育種研究具有重要意義。1材料和方法1.1種子和種子接種試驗(yàn)所用瓜葉菊品種‘小丑’(S.cruentus‘Jester’)5個(gè)花色的種子購(gòu)自美國(guó)GoldSmith公司,花色純正鮮艷,舌狀花上色彩分布均勻。用10%的過(guò)氧化氫表面滅菌10min,無(wú)菌水沖洗4次,接種于不含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上(蔗糖3%、瓊脂0.55%,pH6.1)。每瓶接種5粒種子,每個(gè)花色6瓶。培養(yǎng)室溫度為(25±1)℃,日光燈光源,光照強(qiáng)度2000lx,光周期16h/d。1.2叢生芽的誘導(dǎo)接種25d后,將在基本培養(yǎng)基上萌發(fā)的無(wú)菌苗用手術(shù)刀去根后接入含有6--BA1.0mg/L的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽,每個(gè)花色10瓶,每瓶接種3株。30d后得到大量的無(wú)菌苗,再將其作為外植體接入含有不同濃度6--BA和NAA的MS培養(yǎng)基上(見(jiàn)表1),觀察并記錄叢生芽誘導(dǎo)情況。每個(gè)處理接種10瓶,每瓶接種3株。1.3愈傷組織的誘導(dǎo)以MS為基本培養(yǎng)基,其中不同種類(lèi)和濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑采用三因素四水平的正交設(shè)計(jì)(培養(yǎng)基配方見(jiàn)表2)。將獲得的叢生芽切離,接種在MS培養(yǎng)基中。繼代培養(yǎng)25d后,取無(wú)菌葉片和葉柄為外植體,葉片剪成0.5cm×0.5cm的小塊,葉柄用手術(shù)刀切成0.1cm左右的薄片,分別接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,觀察出現(xiàn)愈傷組織的時(shí)間、出愈率、分化率等。每個(gè)處理葉片和葉柄各接種10瓶,每瓶接種10個(gè)外植體。1.4愈傷組織增殖用手術(shù)刀把獲得的愈傷組織切成0.2cm×0.2cm的小塊,轉(zhuǎn)接到愈傷組織增殖培養(yǎng)基上(見(jiàn)表3)。25d后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)并觀察獲得的愈傷組織狀態(tài)。每個(gè)處理接種5瓶,每瓶接種10個(gè)外植體。1.5根培養(yǎng)基的篩選將獲得的不定芽用手術(shù)刀分離,轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中(見(jiàn)表4),25d后統(tǒng)計(jì)根數(shù)和生根率,篩選最佳生根培養(yǎng)基配方。每個(gè)處理接種10瓶,每瓶接種4株。1.6試苗的培養(yǎng)從繼代培養(yǎng)的不定芽上剪取長(zhǎng)約1.5cm的頂芽,接種至已篩選出的最佳生根培養(yǎng)基中,約20d后,不定根長(zhǎng)至1cm時(shí),將瓶蓋打開(kāi),于組培室煉苗2d后,將試管苗根部瓊脂洗凈,移栽于V(蛭石)∶V(珍珠巖)=1∶1的混合基質(zhì)中,保持基質(zhì)和空氣中的濕度,1個(gè)星期后就可以進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。1.7方差分析與多重比較所得數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel和SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析與多重比較(鄧肯式檢驗(yàn),P=0.01),百分?jǐn)?shù)經(jīng)反正弦(y=arcsinx1/2)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行分析和比較。2結(jié)果與分析2.1無(wú)菌苗萌發(fā)率將滅菌后的種子在MS培養(yǎng)基上播種25d后進(jìn)行萌發(fā)統(tǒng)計(jì),每個(gè)花色均獲得了30株無(wú)菌苗,萌發(fā)率為100%,萌發(fā)勢(shì)整齊,植株生長(zhǎng)健壯(圖1A)。2.2外植體接種對(duì)芽增殖的影響將無(wú)菌苗接入含有6--BA1.0mg/L的培養(yǎng)基中,芽平均增殖倍數(shù)為7.15,將獲得的芽用手術(shù)刀切離后接入含有不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比的MS培養(yǎng)基中,試驗(yàn)結(jié)果表明,外植體接種30d后,芽增殖效果明顯(圖1B),不同花色間有明顯差異。從表5中可以看出,大多花色隨著生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的增加芽個(gè)數(shù)增多,添加6--BA2.0mg/L的MS培養(yǎng)基為最佳,增值倍數(shù)可達(dá)11.10,其次為添加6--BA1.0mg/L和NAA0.1mg/L的MS培養(yǎng)基,增殖倍數(shù)為10.64。2.3naa和2,4--d對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),愈傷組織發(fā)生后,可以在相同的培養(yǎng)基上直接分化出不定芽。由表6可以看出,不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)及濃度組合對(duì)2個(gè)花色品種葉片和葉柄愈傷組織誘導(dǎo)(圖1C)和分化(圖1D)有顯著差異。葉片在愈傷組織誘導(dǎo)和分化中效果優(yōu)于葉柄,平均愈傷組織誘導(dǎo)率為65%,分化率為30%,而葉柄僅為30%和13%。當(dāng)培養(yǎng)基中只存在6--BA時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)為0,可見(jiàn)NAA和2,4--D在愈傷組織誘導(dǎo)和分化中起著重要作用。隨著NAA濃度增加,愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率有逐漸提高的趨勢(shì),NAA濃度為2.0mg/L時(shí)效果最好,3.0mg/L時(shí)大多有所降低。高濃度的2,4--D對(duì)不定芽的發(fā)生有一定的抑制作用,可見(jiàn)NAA在愈傷組織分化中起主要作用。綜上所述,MS+NAA2.0mg/L+6--BA2.0mg/L為最佳不定芽再生培養(yǎng)基,后續(xù)試驗(yàn)證明此培養(yǎng)基也適用于其他3個(gè)花色品種,植株生長(zhǎng)良好。2.4“小鼠說(shuō)”中松解壓試驗(yàn)結(jié)果從表7中可以看出,NAA和6--BA的配合使用對(duì)愈傷組織的增殖效果明顯,增殖倍數(shù)在15.82～28.81之間。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),疏松的黃綠色愈傷組織后期分化率較高,可以達(dá)到65%。綜合考慮增殖效果,發(fā)現(xiàn)NAA和6--BA濃度均為1.0mg/L時(shí),增殖系數(shù)較大(28.81),且獲得的愈傷組織80%為疏松的黃綠色組織。2.5生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的使用對(duì)根系上生根率的影響結(jié)果表明,添加不同濃度的NAA和IBA對(duì)試管苗生根(圖1E)有顯著的促進(jìn)作用(表8)。不同品種間的生根率不同,白色和洋紅色品種生根率最高,在不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上生根率為82.50%和81.67%;粉色品種較難生根,僅為22.20%,但添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后都能達(dá)到80%以上。隨著生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的增加,生根率和生根數(shù)大多都有所提高,添加NAA0.5mg/L或IBA0.5mg/L都能起到明顯的促進(jìn)生根的作用。綜合考慮,1/2MS+NAA0.5mg/L為最佳根誘導(dǎo)培養(yǎng)基,可使白色和藍(lán)色品種生根率達(dá)到100%,其次為1/2MS+IBA0.5mg/L,可使洋紅色品種生根率達(dá)100%。2.6基質(zhì)的安裝在生根培養(yǎng)基中,當(dāng)不定根長(zhǎng)至1cm左右時(shí),將瓶蓋打開(kāi),于組培室煉苗2d后,將試管苗根部用瓊脂洗凈,移栽于蛭石基質(zhì)中(圖1F),保持基質(zhì)和空氣中的濕度。1個(gè)月后進(jìn)行第2次移栽(圖1G),最后定植于V(草炭)∶V(珍珠巖)=1∶1的混合基質(zhì)中,每個(gè)花色移栽30株,統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)試管苗移栽成活率為100%,植株生長(zhǎng)健壯,后期均如期開(kāi)花(圖1H)。2.7再生植株的花色穩(wěn)定性組培再生植株開(kāi)花后,每個(gè)花色分別隨機(jī)選取3個(gè)不同種子再生植株上盛開(kāi)的舌狀花,以播種苗為對(duì)照,每個(gè)植株測(cè)定3次,最后取平均值,觀察再生植株的花色穩(wěn)定性。經(jīng)RHSCC比色和使用色差儀(NF333)對(duì)花色進(jìn)行量化測(cè)定后,發(fā)現(xiàn)相同花色的組培苗與播種苗RHSCC比色結(jié)果相同,CIEL*,a*,b*的值相差很小(表9)。對(duì)同一種子建立的株系的不同單株進(jìn)行花色表型分析,同樣未發(fā)現(xiàn)花色變異。這一結(jié)果表明,本試驗(yàn)建立的再生株系花色表型穩(wěn)定,可以用于后續(xù)試驗(yàn)。3結(jié)論和討論3.1-ba和2,4-d對(duì)火毒蝦誘導(dǎo)的誘導(dǎo)效果本研究以瓜葉菊的種子作為外植體,建立了穩(wěn)定的再生體系,成功地實(shí)現(xiàn)了離體快繁,解決了瓜葉菊只能靠種子繁殖的技術(shù)難題。以MS作為基本培養(yǎng)基,添加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)及濃度發(fā)現(xiàn),瓜葉菊再生過(guò)程對(duì)外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑比較敏感,再生體系各個(gè)階段的生長(zhǎng)情況與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度有一定的相關(guān)性。6--BA對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)起主要作用,在6--BA2.0mg/L的MS培養(yǎng)基中,叢生芽誘導(dǎo)效果最好,增殖倍數(shù)可達(dá)11.10。當(dāng)培養(yǎng)基中6--BA濃度一定時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)率大多隨著NAA和2,4--D濃度的增加而呈上升趨勢(shì),但2,4--D對(duì)不定芽的分化具有一定的抑制作用,所以研究認(rèn)為NAA和6--BA的配合使用效果最佳,MS+NAA2.0mg/L+6--BA2.0mg/L為最適宜的誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基,誘導(dǎo)效果葉片優(yōu)于葉柄,這可能與其不同的組織結(jié)構(gòu)及品種相關(guān)。本研究與張永樂(lè)等的研究結(jié)果不同,他們發(fā)現(xiàn)葉柄是瓜葉菊組織培養(yǎng)的最佳外植體。研究中還發(fā)現(xiàn),當(dāng)NAA和6--BA濃度均為1.0mg/L時(shí)愈傷增殖效果明顯。在1/2MS培養(yǎng)基中添加0.5mg/LNAA或IBA,都能促進(jìn)試管苗根的發(fā)育,生根率在80%以上?？梢?jiàn),6--BA和NAA是瓜葉菊再生體系中最適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,這與于曉英等的研究結(jié)果相似。3.2種子外植體的制備本文利用瓜葉菊種子為外植體,通過(guò)研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和濃度的作用,建立了瓜葉菊5個(gè)花色品種的高效再生體系,獲得了再生植株,突破了瓜葉菊繁殖的技術(shù)難題,為瓜葉菊的良種繁育及轉(zhuǎn)基因育種研究提供了一條有效途徑。瓜葉菊葉片表面絨毛較多,滅菌難度較大。莖段是組培中最常用的外植體,但瓜葉菊莖段粗短,可用材料較少,給離體快繁體系的建立增加了難度。本研究采用種子為外植體,直接獲得無(wú)菌苗,省去了再滅菌的工序,保證了穩(wěn)定的外植體來(lái)源,并縮短了培養(yǎng)周期。研究中還發(fā)現(xiàn),相比對(duì)照播種苗,組培苗出瓶后長(zhǎng)勢(shì)健壯,植株整齊一致。對(duì)比同類(lèi)研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于這些外植體取材困難的植物,利用種子作外植體啟動(dòng)培養(yǎng),繼而利用試管中的播種苗進(jìn)行再生體系的研究,可以在一定程度上解決繁殖困難。很多研究者已經(jīng)利用此方法開(kāi)展了相關(guān)研究,如以豌豆(Pisumsativum)、卡西豬籠草(Nepentheskhasiana)、喇叭唇石斛(Dendrobiumlituiflorum)、鳥(niǎo)足蘭(Satyriumnepalense)、草本蔓長(zhǎng)春花(Vincaherbacea)、紅三葉草(Trifoliumpratense)等植物的種子作為外植體,已經(jīng)成功獲得了無(wú)菌苗或體胚。利用這一技術(shù),對(duì)觀賞植物中一、二年生草花進(jìn)行繁殖,是行之有效和快速的方法。3.3瓜葉菊花瓣的分子機(jī)理一直以來(lái),培育新異花色品種是各國(guó)育種工作者重要的育種目標(biāo)之一,藍(lán)色花的分子育種更是園藝工作者的研究熱點(diǎn)。日本大阪Suntory有限公司和澳大利亞ColgenePacific股份有限公司聯(lián)合開(kāi)展了藍(lán)色月季分子育種工作。其中,Florigene和Suntory公司已經(jīng)培育出了一系列的藍(lán)紫色的香石竹(Dianthuscaryophyllus)品種,這些品種已經(jīng)在美國(guó)、日本、澳大利亞和歐洲一些國(guó)家上市6～10年了,其藍(lán)色月季也已經(jīng)投放到市場(chǎng)上。相比之下,我國(guó)藍(lán)色花育種進(jìn)程相對(duì)緩慢。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于瓜葉菊花色的研究多限于其分子機(jī)理的研究,花青素合成途徑中的很多重要結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)被克隆出來(lái),其中F