實驗十 pUC57 T載體的制備

22實驗十pUC57T載體的制備．原理PCR產(chǎn)物的克隆是一種有效的克隆目的基因的方法，但是在實際應(yīng)用中，由于方法學(xué)上的一些技術(shù)問題可能限制其應(yīng)用。由于PCR產(chǎn)物3'末端突出一個A,因此克隆PCR產(chǎn)物的載體3'末端必須突出一個T,這樣載體與PCR產(chǎn)物之間形成粘性長端?，F(xiàn)在許多公司開發(fā)出了此類專用于PCR產(chǎn)物克隆的T載體。本實驗中將平端內(nèi)切酶EcoRv酶解的EcoRv，用Taq酶將其3'末端加上T,然后用T4連接酶將能自身環(huán)化的質(zhì)粒連接。用凝膠電泳將自身環(huán)化的質(zhì)粒與3'末端帶有T.不能自身環(huán)化的線性質(zhì)粒分開，回收線性質(zhì)粒片段即為pUC57T載體。二.方法制備pUC57質(zhì)粒DNA。(見實驗一)用EcoRV酶解pUC57DNA。(見實驗九)在酶解的pUC57DNA末端加上T。取一支0.5ml微離心管.加入：EcoRV酶解的pUC57DNA10pgTOC\o"1-5"\h\z10XPCR緩沖液15pldTTP10mmol/L20plTaqDNA聚合酶(5U/pl)1plddHOto150|jl10000r/min離心5s混勻，72°C水浴2h。DNA片段的純化在上述0.5ml微離心管中加入等體積(15pl)酚/氯仿混勻，放置數(shù)分鐘，5000r/min離心5min.使液體分層。吸收酚/氯仿抽捉提之水相至另一1.5ml離心管中，加入1/10體積的乙酸鈉，加2倍體積冷無水乙醇，混勻。-20C冰箱放置2h，15000r/min離心15min。傾去乙醇，加入70％冷乙醇淋洗。傾去乙醇，濾紙吸干，真空抽吸2?3min。加人30plddH2O,溶解DNA。載體DNA自身連接2在DNA片段純化管中，加入5pl10x連接酶緩沖液和2UT4DNA連接酶，并用重蒸水補至總體積50pl。16C連接16小時。瓊脂糖凝膠電泳將DNA連接液在l%(Wt/V01)瓊脂糖凝膠上電泳分離pUC57T載體和原載體pUC57T載體的純化用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化線性載體，井用電泳對此載體進行定量。10mmol/LdTTP。TaqDNA聚合酶，5U/pl酚/氯仿。乙醇.放置-20C冰箱保存?zhèn)溆?。乙酸鈉，70％冷乙醇ddHO。8．瓊脂糖。9．T4DNA連接酶。10．10X連接酶緩沖液。11．溴酚藍指示劑12．EB溶液13?瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒四．說明本實驗是一個典型的將具有平齊末端的線性DNA片段變成粘性片段的方法。在基因工程過程中.經(jīng)常要將平齊末端轉(zhuǎn)變?yōu)檎承阅┒嘶蛞獙⒄承阅┒宿D(zhuǎn)變?yōu)槠烬R末端，除了本實驗中的方法外.還有下列方法：在平齊末端產(chǎn)生新限制性內(nèi)切酶位點的方法試劑T4DNA連接酶10xT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液300mmol／LTris-HCI，pH7.8100mmol／LMgCl100mmol／LDTT10mmol／LATP注：10X連接酶緩沖液應(yīng)-20°C保存。不要多次凍存和融化。連接緩沖液中ATP降解連接反應(yīng)失敗的最常見原因。磷酸化限制酶接頭無核酸酶重蒸水限制性內(nèi)切酶及其緩沖液氯仿：異戊醇(24：1)TE緩沖液10mmol／LTris—HCIlmmol／LEDTA酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)混合等體積的TE緩沖液與重蒸酚，分層后，再將1份下層酚相與1份氯仿：異戊醇(24：1)混合即可。原理限制酶接頭是合成的DNA雙鏈，含有限制性內(nèi)切酶識別序列，可用于將一個新的限制性內(nèi)切酶位點加入到含平端的DNA片段上。商品化的接頭有5'末端磷酸化和非磷酸化兩種。磷酸化的接頭更適于本實驗.因為T4DNA連接酶需要一個DNA模板5'末端含磷酸基團。使用磷酸化的接頭可以與非磷酸化的載體連接，這樣可以降低載體自身重新連接的背景。方法取一微離心管，分別加入：TOC\o"1-5"\h\z10XT4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液1|JlDNA(100—500ng)1pl磷酸化限制酶接頭超過DNA片段的摩爾數(shù)100倍?T4DNA連接酶(Weiss單位)2.5u加無核酸酶蒸餾水至lO|Jl*注：1pglkbDNA片段約為1.52pmol.商品限制酶接頭常以A度量對于10堿基的260限制酶接頭，0.015A的量相當(dāng)于大約152pmolDNA。26015°C反應(yīng)6?18小時。70C加熱10分鐘終止反應(yīng)。立即在冰上冷卻反應(yīng)管，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行酶解，酶解后，加等體積酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)到反應(yīng)管中提取DNA，振搖l分鐘，12000g離心5分鐘。轉(zhuǎn)移上層水相至另一新離心管中.為增加回收率，有機相用小量TE緩沖液重提一次。加等體積氯仿；異戊醇(2J1：1),振搖30秒，12OOOg離心2min，移上層水相至另新管中。用瓊脂糖凝膠電泳除掉未連接的限制酶接頭片段，從膠中川收DNA片段。將5'突出末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠蕉说姆椒ㄔ噭?無核酸酶重蒸水限制性內(nèi)切酶及其緩沖液氯仿：異戊醇(2/1：1)TE緩沖液10mmol／LTris-HCllmmol/LEDTA酚：氯仿；異戊醉(24:1)3mol/L乙酸鈉，pH5.2無水乙醇70%乙醇DNA聚合酶大片段(Klenow)10XDNA聚合酶Klenow片段緩沖液500mmol/LTris—HCl，pH7.2100mmol/LMgSO4lmmol/LDTFT4DNA聚合酶10xT4DNA聚合酶緩沖液330mmol/LTris—乙酸pH7.9660mmol/L乙酸鉀100mmol/L乙酸鎂5mmol/LDDT乙?；Ｑ灏椎鞍?，1mg/mldNTPs.100mmol/L原理Klenow(DNA聚合酶大片段)及T4DNA聚合酶都能利用dNTPs補齊5'突出末端Klenow聚合酶法酶解DNA.形成5、突出末端。加等體積酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)到反應(yīng)管中提取DNA,振搖1分鐘，12000g離心5分鐘。轉(zhuǎn)移上層水相至另一新離心管中，為增加回收率，有機相用小量TE緩沖液重提一次。加0.1體積3mol/L乙酸鈉和2體積無水乙醇，冰上或-20C放置15?30分鐘，沉淀DNA。4°C12OOOg離心10分鐘.如果DNA濃度較低，小于100ng/ml，離心時間為30分鐘這樣可增加DNA的回收率。注：小量DNA的回收也可通過加入核酸如酵母DNA到樣品中，使其終濃度達50pg/ml,而改進回收效果。如果tRNA會影響以后DNA的應(yīng)用，也可使用糖原。離心棄上清.加200pl70%乙醇。12OOOg4C離心5分鐘。小心移去上清，空氣中干燥沉淀。用含：40pmol/L每種dNTP及0.1mg/ml乙?；Ｑ灏椎暗膌倍Klenow酶緩沖液溶解DNA.每微克DNA加入1ulqenowDNA聚合酶?？偡磻?yīng)體積在10一100之間均可。KlcnowDNA聚合酶在許多限制酶反應(yīng)緩沖液中(如Promemt的核心緩沖液)有一定活性。這樣可直接將酶及40pmol/L每種dNTP加入到限制酶反應(yīng)后的反應(yīng)管中，省略以上的①?⑦步。將反應(yīng)管置室溫中反應(yīng)10分鐘75C作用10分鐘終止反應(yīng)。(2)T4DNA聚合酶法采用Klenow聚合酶法的①一⑦步驟純化DNA。用含100pmol/L每種dNTP和0.1mg/ml乙?；Ｑ灏椎鞍椎?倍T4DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液溶解DNA。每微克DNA加5uT4DNA聚合酶75C作用10分鐘終止反應(yīng)。3?將3'突出末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠蕉说姆椒?1)試劑無核酸酶重蒸水限制性內(nèi)切酶及其緩沖液氯仿：異戊醇(24：1)TE緩沖液lOmmol/LTris—HCIlmmol/LEDTA酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)3mol/L乙酸鈉，pH5.2無水乙醇70%乙醇T4DNA聚合酶10xT4DNA聚合酶緩沖液330mmol/LTris—乙酸，pH7.9660mmol/L乙酸鉀100mmol/L乙酸鎂1mmol/LDTT乙?；Ｑ灏椎鞍譫NTPs,100mmol/L原理在過量dNTP存在下T4DNA聚合酶具有3'一5,核酸外切酶活性，能將3,突出末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠烬R末端。方法酶解DNA，形成3'突出末端。加等體積酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)到反應(yīng)管中提取DNA,振搖1分鐘，12000g離心5分鐘。轉(zhuǎn)移上層水相至另一新離心管中，為增加回收率，有機相用小量TE緩沖液重提一次。加0.1體積3mol/L乙酸鈉和2體積無水乙醇，冰上或-20°C放置15?30分鐘，沉淀DNA。4C12000g離心10分鐘，如果DNA濃度較低，小于100ng/m1，離心時間為30分鐘，這樣可增加DNA的回收率。注：小量DNA的回收也可通過加入核酸如酵母DNA到樣品中，使其終濃度達50pg/ml而改進回收效果。如果tRNA會影響以后DNA的應(yīng)用，也可使用糖原。離心棄上清，加200》170%乙醇，12000g4C離心5分鐘。小心移去上清，空氣中干燥沉淀。用含100pmol/L,每種dNTP及0.1mg/ml乙?；Ｑ灏椎鞍椎?倍T4DNA聚合酶緩沖液溶解DNA。0.2?5pgDNA的反應(yīng)體積為20p1,每微克DNA加5uT4DNA聚合酶。37C反應(yīng)5分鐘。注：高濃度的dNTPs(100|Jmol/L)將使DNA的降解終止在雙鏈DNA處，。然而，如果dNTPs含量太低，TIDNA聚合酶的外切酶活性則很高.可使雙鏈DNA降解。在本反應(yīng)中，所有4種dNTP都必須有。75C作用10