丹參酚酸b對(duì)單側(cè)輸尿管淋巴結(jié)大鼠腎纖維化作用機(jī)制的研究

丹參酚酸b對(duì)單側(cè)輸尿管淋巴結(jié)大鼠腎纖維化作用機(jī)制的研究

根據(jù)中醫(yī)理論和臨床經(jīng)驗(yàn)，慢性腎衰竭的發(fā)病機(jī)制主要是以虛標(biāo)虛、虛正虛、虛外為標(biāo)，最后導(dǎo)致腎衰竭和絡(luò)脈結(jié)構(gòu)。丹參酚酸B(Salvianolic-acidB,SA-B)為臨床常用的活血化瘀中藥丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)中提取的水溶性成分,丹參具有較好的抗肝腎纖維化作用。SA-B具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化和清除自由基作用,還具有抗肝損傷、抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善記憶功能障礙和影響鈉-鉀-ATP酶活性等藥理作用,是一種有著廣闊發(fā)展前景的中藥提取物。SA-B在腎纖維化領(lǐng)域研究較少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SA-B對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻模型進(jìn)行干預(yù),觀察該藥物對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表達(dá)的影響,以探討其抗腎間質(zhì)纖維化作用可能的機(jī)制。1材料表面1.1美國(guó)西基于scxk-d002雄性SPF級(jí)SD大鼠18只,體質(zhì)量(225±25)g,上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(滬)2003-D002。所有大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)環(huán)境為每籠6只,普食喂養(yǎng)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑SA-B粉末,純度80%,水溶性較好,分子量為718,分子式C36H30O16,上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所惠贈(zèng)。小鼠抗人α-SMA單抗、小鼠抗人E-cad單抗,美國(guó)sigma;HRP-GAPDH,上?？党缮锕こ坦?BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒,美國(guó)Pierce公司;DAB顯色試劑盒,華美生物;PV6002二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒,北京中杉。2腎組織-sma、e-cad免疫海蘭灰的檢測(cè)2.1動(dòng)物模型的建立及分組將SD大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組6只,分離但不結(jié)扎左側(cè)輸尿管;模型組6只,大鼠行手術(shù)結(jié)扎左側(cè)輸尿管近腎盂段;治療組6只,造模后第2天灌胃SA-B水溶液,濃度1.25mg/mL,劑量12.5mg/kg,灌胃體積為10mL/kg,用時(shí)臨時(shí)配制(臨床等效劑量的10倍)。模型組和假手術(shù)組分別以等體積生理鹽水灌胃。2.2檢測(cè)指標(biāo)和方法大鼠于術(shù)后14d腹主動(dòng)脈取血處死大鼠,1/4腎組織常規(guī)組織制片和電鏡制片,3/4腎組織液氮凍存后轉(zhuǎn)-80℃?zhèn)浞肿由飳W(xué)檢測(cè)用。2.2.1病理學(xué)觀察:梗阻側(cè)腎組織常規(guī)HE染色光鏡下觀察大鼠腎小管和腎間質(zhì)改變;常規(guī)電鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞的改變。2.2.2大鼠腎組織α-SMA、E-cad蛋白表達(dá)的測(cè)定:蛋白印跡法(Westernblot)檢測(cè)。腎組織標(biāo)本經(jīng)勻漿器充分研磨,裂解液裂解提取蛋白后,采用BCA法定量蛋白濃度。蛋白變性后在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離,完畢后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%的脫脂奶粉封閉1h后,先后加入小鼠抗人α-SMA單抗(1∶6000)、小鼠抗人E-cad單抗(1:2000),4℃過(guò)夜,去一抗,TTBS緩沖液洗3次,10min/次,再加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(1∶5000、1∶2000),室溫孵育2h,洗膜后,經(jīng)化學(xué)發(fā)光法在X片上顯影并掃描結(jié)果條帶,測(cè)定光密度值。采用特異性基因光密度/管家基因光密度(GAPDH)相對(duì)定量。2.2.3大鼠腎組織α-SMA、E-cad免疫組織化學(xué)染色觀察:常規(guī)脫蠟至水,PBS洗5min后,3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,室溫10min。PBS洗5min×3后,0.4%胃蛋白酶消化,37℃,30min;PBS洗5min×3后,切片置檸檬酸緩沖液(0.01mol/L,pH6.0)中,微波中高檔加熱10min(注意不要沸騰),取出自然冷卻至室溫。PBS洗5min×3后,5%BSA封閉液(1g牛血清白蛋白干粉溶于20mLPBS),37℃孵育30min。甩去封閉液后滴加一抗(以封閉液稀釋,濃度如下:α-SMA1∶500、E-cad1∶200),以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,置濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。PBS洗5min×3后,擦片后滴加二抗(PV6002二步法免疫組化檢測(cè)試劑),置濕盒內(nèi)37℃孵育30min。PBS洗5min×3次后,DAB-H2O2顯色不超過(guò)10min,鏡下觀察,水洗終止顯色。蘇木素復(fù)染,1%鹽酸乙醇分化,無(wú)水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用ˉx±sxˉ±s表示,采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異性比較采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。3結(jié)果3.1腎間質(zhì)病理變化結(jié)果如圖1所示,HE染色光鏡下觀察,可見(jiàn)假手術(shù)組腎小球形態(tài)規(guī)則,腎小管排列緊密,小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常,呈典型的單層立方上皮;模型組腎皮質(zhì)顯著變薄,腎小管、集合管擴(kuò)張呈囊狀,可見(jiàn)管腔塌陷,部分腎小管萎縮,腎小管上皮細(xì)胞大量萎縮、壞死,細(xì)胞形態(tài)變得扁平。腎間質(zhì)中大量單核與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞增殖顯著,而腎小球、小血管無(wú)顯著改變;治療組較模型組的腎小管擴(kuò)張,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腎間質(zhì)損傷等均顯著減輕。電鏡下觀察模型組腎小球基本正常,腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散,濁腫,到后期部分壞死脫落到小管管腔或間質(zhì)內(nèi),小管基底膜不完整,腎間質(zhì)顯著增寬,膠原纖維沉積逐漸增多,間質(zhì)細(xì)胞增多和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。治療組腎小管上皮細(xì)胞變性壞死等較模型組減輕,小管擴(kuò)張和膠原纖維沉積減少。3.2-sma蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖2、3所示,Westernblot結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠腎組織僅表達(dá)微量α-SMA蛋白,模型組的表達(dá)顯著升高(P<0.01),SA-B干預(yù)后,其α-SMA蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠腎組織E-cad高水平表達(dá),模型組E-cad僅微弱表達(dá)(P<0.01),治療組也低水平表達(dá),但略高于同期模型組(P>0.05)。3.3腎組織-sma表達(dá)情況結(jié)果如圖4、表1所示,免疫組化結(jié)果顯示,假手術(shù)組α-SMA僅在腎臟小動(dòng)脈平滑肌上表達(dá),造模2w后,模型組α-SMA在腎小管上皮細(xì)胞及小管間質(zhì)均大量表達(dá),治療組腎間質(zhì)中α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較模型組減少,在小管上皮亦有表達(dá);陽(yáng)性面積分析,模型組腎組織α-SMA陽(yáng)性面積較假手術(shù)組顯著增加(P<0.05),治療組較模型組顯著減少(P<0.05)。各組大鼠E-cad均表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞,模型組腎小管結(jié)構(gòu)松散,治療組腎小管結(jié)構(gòu)好于模型組。模型組腎小管上皮E-cad陽(yáng)性面積較假手術(shù)組有減少趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);SA-B組較模型組呈增加趨勢(shì),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4uio大鼠中腎組織-sma的表達(dá)UUO致腎間質(zhì)纖維化是經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,腎間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn),這些改變最終導(dǎo)致腎小管萎縮,腎實(shí)質(zhì)被纖維組織取代,腎小管間質(zhì)纖維化,而腎小球相對(duì)不受影響。從本實(shí)驗(yàn)的大鼠腎組織病理切片光鏡、電鏡下可以觀察到,UUO術(shù)后2w可見(jiàn)擴(kuò)張和萎縮的腎小管相繼出現(xiàn),腎間質(zhì)顯著增寬,內(nèi)有大量的炎癥細(xì)胞,并出現(xiàn)較多的膠原纖維,提示大鼠梗阻腎發(fā)生廣泛的腎小管上皮細(xì)胞壞死及腎間質(zhì)纖維化。SA-B治療組較模型組的腎小管擴(kuò)張,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腎間質(zhì)損傷等均顯著減輕。腎間質(zhì)纖維化是指由多種原因引起的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix,ECM)成分在腎間質(zhì)內(nèi)過(guò)度沉積。不論是何種腎臟原發(fā)病,進(jìn)展到終末期,均以進(jìn)行性腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少和ECM沉積為特點(diǎn)。導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞——肌纖維母細(xì)胞,部分來(lái)源于活化后發(fā)生表型轉(zhuǎn)分化的腎小管上皮細(xì)胞,而α-SMA、F-actin等被公認(rèn)為肌纖維母細(xì)胞的表型標(biāo)志物,其在腎小管間質(zhì)的表達(dá)程度與腎間質(zhì)纖維化相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)觀察到,UUO術(shù)后2w大鼠梗阻腎的腎組織內(nèi)有大量α-SMA蛋白表達(dá),而同期的假手術(shù)組腎組織內(nèi)α-SMA表達(dá)很微弱(P<0.01)。SA-B治療組大鼠腎組織α-SMA蛋白表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示假手術(shù)組腎小管上皮α-SMA表達(dá)陰性,模型組腎小管上皮細(xì)胞α-SMA陽(yáng)性表達(dá),同時(shí)小管間質(zhì)中也存在大量的α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞(P<0.05),SA-B治療組腎間質(zhì)中α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較模型組減少(P<0.05)。提示UUO大鼠梗阻腎的腎小管間質(zhì)已有大量的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞。由此推測(cè),UUO模型造成的腎間質(zhì)纖維化中,一方面是腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型改變,產(chǎn)生肌纖維母細(xì)胞,對(duì)腎臟纖維化起到重要促進(jìn)作用,另一方面,間質(zhì)成纖維細(xì)胞發(fā)生增殖活化加重腎臟纖維化。而SA-B能抑制腎小管上皮-間質(zhì)的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,降低肌纖維母細(xì)胞在腎小管間質(zhì)的積聚,減輕腎間質(zhì)纖維化程度。維持穩(wěn)定的細(xì)胞連接需要E-cad存在,抗E-cad蛋白抗體可破壞細(xì)胞間的連接,并誘發(fā)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。目前認(rèn)為E-cad介導(dǎo)的細(xì)胞間連接的破壞主要存在以下幾種機(jī)制:E-cad表達(dá)下調(diào)和基因突變,失去其連環(huán)素結(jié)合區(qū),無(wú)法形成有功能是黏附復(fù)合體;連環(huán)素的下調(diào)表達(dá)、突變