六味地黃湯對缺氧誘導因子-1、血小板源性生長因子-a及pdgf-b在慢性腎功能衰竭大鼠腎組織中的表達及作用

六味地黃湯對缺氧誘導因子-1、血小板源性生長因子-a及pdgf-b在慢性腎功能衰竭大鼠腎組織中的表達及作用

根據研究，多種原因引起的慢性腎臟疾病（kd）常見。慢性缺氧是終末期腎疾病的最后一條共同通道。英國學者Fine提出的“慢性缺氧學說”成為目前CKD學界研究的熱點。該學說提出,腎小管間質部分的慢性氧缺失是促進腎臟疾病進展和纖維化的重要原因。缺氧可增加缺氧誘導因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)表達,而HIF可上調結締組織生長因子(CTGF)、血漿纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)、組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)等,促使腎間質纖維化。血小板源性生長因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)能夠促進肌纖維母細胞產生膠原,并通過抑制膠原酶,減少細胞外基質(ECM)的降解,最終導致ECM合成增多、降解減少,過度沉積,形成纖維化。本研究旨在通過體內動物實驗探討HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B在腎間質纖維化中的表達和作用,以及六味地黃湯對其表達的影響。1材料和方法1.1湖南中醫(yī)藥scxk動物SPF級雄性SD大鼠30只,體質量(200±10)g,湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK(湘)2009-0001,飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級動物房。1.2原藥材/ml六味地黃湯(熟地黃24g,山藥12g,山萸肉12g,澤瀉9g,茯苓9g,牡丹皮9g)飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科。先將藥材用5倍自來水浸泡2h,煮沸后再微火煎熬30min,過濾后收集煎液,原藥渣加少量水煎煮,取二煎液。將兩煎液混合,于水浴恒溫器上濃縮為1g原藥材/mL。一抗為兔抗大鼠HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B多克隆抗體(美國SantaCruz),PV-6001二步法免疫組化檢測試劑盒,二抗山羊抗兔IgG-HRP多聚體PV-6001(北京中杉金橋公司),DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司),Trizol(美國MRC公司),引物為英濰捷基(上海)貿易有限公司合成,RT試劑盒(美國Fermentas公司),反轉錄試劑盒(Promega公司),TaqDNA聚合酶和dNTPs(美國Fermentas公司)。1.3腎組織手術組參考文獻方法,以10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉動物,常規(guī)消毒鋪巾,從左腹部切口,打開腹腔,靜脈夾夾住腎蒂后切除左腎上下極(切除2/3),以明膠海綿壓迫止血,復位腎臟,1周后進行第2次手術,切除右側腎臟。假手術組采取同樣步驟,打開腹腔暴露腎臟后避免牽拉腎臟,不切除腎臟。1.4各組小鼠腎切除SD雄性大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為假手術組、模型組和六味地黃湯組,每組10只,模型組、六味地黃湯組均在無菌條件下進行5/6腎切除術。1.5藥劑量及灌胃量造模后第2日,六味地黃湯組予以六味地黃湯煎煮方灌胃,給藥劑量按70kg成人的體表面積換算。假手術組和模型組以等容積蒸餾水灌胃,每日1次,連續(xù)12周。灌胃量:10mL/(kg·次)。各組大鼠灌胃中途死亡者予以剔除。1.6腎組織病理學檢測各組大鼠均于造模12周后處死,處死前收集24h尿液,ELISA法檢測24h尿白蛋白(24hUAlb);腹主動脈采血分離血清,酶法測定血肌酐(SCr)濃度,尿素酶-GLDH法測定尿素氮(BUN)濃度。腎組織分為兩部分處理:(1)光鏡觀察。標本用4%多聚甲醛固定,分別進行HE染色、Masson染色及免疫組化檢測;(2)腎組織取出后立即放入液氮罐中,隨后轉入-80℃冰箱保存待用,用于RT-PCR檢測。1.7指標測定1.7.1腎組織病理學觀察腎組織經4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為3~4μm)后,常規(guī)HE染色及Masson染色,Olympus顯微鏡觀察各組腎組織病理變化并拍照。1.7.2數(shù)碼醫(yī)學分析免疫組化PV二步法染色,一抗用兔抗大鼠HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B抗體,二抗用相應山羊抗兔IgG-HRP多聚體(工作濃度按產品說明書配制為1∶100),染色呈棕褐色或棕黃色者為陽性染色。Olympus顯微鏡觀察每張切片并隨機選取5個視野,用麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學分析系統(tǒng)(MoticMed6.0)進行圖像分析。觀察視野內免疫陽性細胞的平均灰度值,半定量法評估,測得組織細胞平均灰度值愈小,其蛋白水平愈高。1.7.3反應條件用Trizol法提取總RNA,于15μL反應體系中進行反轉錄反應合成cDNA,PCR擴增目的基因HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B及內參基因β-actin片段。引物設計與合成:按GenBank數(shù)據庫檢索目的序列,Primer引物設計與分析軟件設計引物。引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。反應條件:94℃變性5min,循環(huán)采用94℃變性0.5min,56℃退火0.5min,72℃延伸0.5min,35個循環(huán)后,72℃延伸10min。引物序列:HIF-1α上游5’-GTTTACTAAAGGACAAGTCACC-3’,下游5’-TTCTGTTTGTTGAAGGGAG-3’;PDGF-A上游5’-GAGATACCCCGGGAGTTGAT-3’,下游5’-AAATGACCGTCCTGGTCTTG-3’;PDGF-B上游5’-CCCACAGTGGCTTTTCATTT-3’,下游5’-GTGGAGGAGCAGACTGAAGG-3’;內參(β-actin1)上游5’-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3’,下游5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’;內參(β-actin2)上游5’-GCCAACCGTGAAAAGATG-3’,下游5’-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3’。以上PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析目的條帶的灰度值。1.8均數(shù)展望和分析方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料用—x±s表示,多組均數(shù)的比較采用方差分析,組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LDS-t),相關分析采用Pearson相關分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1腎功能檢測結果見表12.2腎間質纖維組織造模后12周,HE染色下假手術組腎小球結構清晰,腎小管上皮細胞排列整齊,基底膜完整,間質中未見炎癥細胞浸潤;模型組腎小球纖維化、玻璃樣變,腎小管萎縮、消失,部分腎小管發(fā)生代償性擴張,可見蛋白管型,腎間質纖維組織增生明顯及大量淋巴細胞為主炎細胞浸潤;六味地黃湯組病理變化較模型組明顯減輕。Masson染色下假手術組腎小球、腎小管無異常,腎間質無明顯膠原纖維;模型組腎小球硬化,腎小管數(shù)量明顯減少,腎間質見大量的膠原纖維;六味地黃湯組腎間質可見少量膠原纖維,纖維化程度明顯減輕。2.3免疫組化檢測結果2.3.1各組小鼠肝腎上皮細胞表達比較造模后12周,假手術組HIF-1α在腎小管上皮細胞均有微量表達,模型組和治療組腎小管上皮細胞胞漿和胞核中HIF-1α表達增加,尤以近曲小管表達明顯,腎小球未見明顯表達。2.3.2皮細胞漿和胞核中pdgf-a表達增加,小鼠肝腎組織pgf-a表達,將pdgf-a造模后12周,假手術組PDGF-A的表達不明顯,模型組和六味地黃湯組腎小管上皮細胞胞漿和胞核中的PDGF-A表達增加,腎小球表達不明顯。2.3.3血小板起源生長因子b的出現(xiàn)造模后12周,假手術組PDGF-B表達不明顯,模型組和六味地黃湯組腎小管上皮細胞胞漿和胞核中PDGF-B表達增加,腎小球微量表達。2.3.4兩組實證結果比較造模后12周,腎組織HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B的表達在模型組最強,六味地黃湯組次之,假手術組最弱。模型組HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B蛋白水平均明顯高于假手術組(P<0.01);六味地黃湯組HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B蛋白水平均明顯低于模型組(P<0.01)。見表2。PDGF-A、PDGF-B與HIF-1α的蛋白水平呈正相關。2.4兩組患者血清中機制比對模型組HIF-1α、PDGF-A和PDGF-BmRNA表達均明顯高于假手術組(P<0.01),六味地黃湯組HIF-1α、PDGF-A和PDGF-BmRNA表達均明顯低于模型組(P<0.01),見圖1、表3。PDGF-A、PDGF-B與HIF-1αmRNA表達呈正相關。3雞雞mda的表達慢性腎功能衰竭(chronicrenalfailure,CRF)是各種腎臟疾病持續(xù)進展的最終結局,其主要病理學特征為慢性腎臟纖維化。HIF-1是1992年Semenza等在低氧誘導的肝細胞癌細胞株Hep3B細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異性轉錄因子。目前研究表明,缺氧環(huán)境下腎小管上皮細胞可穩(wěn)定表達HIF-1α并促進間質纖維化,因此,HIF-1α可能是導致各器官纖維化的關鍵因子。PDGF是從血小板中分離出的一種重要的促有絲分裂因子,具有刺激特定細胞群分裂增殖的能力。PDGF家族至少有4個亞基,即PDGF-A、B、C、D,其中PDGF-A和PDGF-B是經典的PDGF存在形式。已有研究表明,PDFG表達受HIF-1α的調控。Shin等在缺氧條件下體外培養(yǎng)胚胎干細胞,HIF-1α表達增加并可上調PDGF的表達,而在棘霉素阻斷HIF-1α后,PDGF表達也隨之下降。Mermis等通過研究HIV轉基因大鼠認為病毒蛋白誘導的氧化應激依賴于HIF-1α上調PDGF-B的表達。Ishizuka等研究缺氧的間充質干細胞發(fā)現(xiàn),增加細胞內超氧陰離子水平可能減輕HIF-1α表達,從而減輕缺氧誘導血管內皮生長因子和PDGF-B的轉錄。Mizuno等研究發(fā)現(xiàn),慢性缺氧導致肺動脈高壓過程中,HIF-1α持續(xù)表達,并可上調PDGF的表達,促進血管平滑肌細胞增殖。另有研究表明,PDGF的表達與肝纖維化關系密切。Moon等通過結扎小鼠膽總管復制肝纖維化模型,發(fā)現(xiàn)野生型小鼠HIF-1α蛋白水平在術后3d明顯升高,而在HIF-1α基因敲除小鼠無明顯升高。在結扎后第7、14日分別檢測PDGF-A、PDGF-BmRNA,發(fā)現(xiàn)PDGF-A、PDGF-B基因表達水平在野生型小鼠較HIF-1α基因敲除小鼠增加更明顯。Copple等早期研究發(fā)現(xiàn),肝細胞缺氧可激活HIF-1α,后者調節(jié)PDGF-A、PDGF-B基因表達,促進肝纖維化。后來研究HIF基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)其體內的PDGF-B蛋白水平和基因表達均明顯減少,從而推測HIF還可能通過上調巨噬細胞表達PDGF-B,從而促進纖維化。本研究采用的5/6腎切除法是目前研究CKD進展的理想動物模型。已有研究表明,5/6腎切除的大鼠腎臟組織中存在小動脈病變,這種小動脈病變可導致腎小球后毛細血管血流減少和小管間質缺血,而缺血就意味著低氧。Manotham等研究顯示,5/6腎切除的大鼠模型在發(fā)生小管纖維化前,腎小管已存在明顯的缺氧。Zhang等經研究5/6腎切除的大鼠模型同樣顯示,管周毛細血管丟失和腎小管間質缺氧在腎間質纖維化不明顯之前的早期階段(術后第3周)已經很嚴重,并且持續(xù)存在于腎間質纖維化的發(fā)展過程中。Zeng等發(fā)現(xiàn),HIF-1α在5/6腎切除大鼠腎組織中顯著升高,這一結果表明慢性缺氧存在于5/6腎切除大鼠模型。俞氏等研究5/6腎切除大鼠亦發(fā)現(xiàn),在早期階段(術后第1周末),HIF-1α在腎內表達即開始增加,在術后12周仍有持續(xù)表達。本研究顯示:5/6腎切除術后12周,HE和Masson染色均顯示模型組存在明顯纖維化,且腎功能指標均明顯異常,說明造模成功。模型組HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B的蛋白水平和基因表達均明顯高于假手術組(P<0.01),且PDGF-A、PDGF-B的表達和HIF-1α具有相關性(P<0.01),提示HIF-1α可能通過上調PDGF-A、PDGF-B的表達促進腎臟纖維化。六味地黃湯是臨床上治療腎陰虛證型慢性腎小球腎炎的有效方劑。其臨床療效肯定,然其具體作用機制尚未闡明,何氏等研究發(fā)現(xiàn),給5/6腎切除大鼠灌胃六味地黃湯8周后,其血清BUN、SCr的水平明顯低于模型組,并能減少留存腎系膜細胞的增生及間質纖維化,