一研-抗VEGF人源化單抗工作總結(jié)(2005-4)

抗VEGF人源化單抗2010年1月18日第一研究室梁紅遠目錄研究背景目的蛋白表達與純化抗VEGF鼠單抗制備及篩選抗VEGF單抗人源化12342011/1/182目錄研究背景目的蛋白表達與純化抗VEGF鼠單抗制備及篩選抗VEGF單抗人源化12342011/1/183血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與疾病2011/1/184Avastin腫瘤轉(zhuǎn)移性結(jié)、直腸癌轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤乳腺癌等血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與疾病2011/1/185Lucentis眼科疾病年齡相關(guān)性視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變角膜移植病變等目錄研究背景目的蛋白表達與純化抗VEGF鼠單抗制備及篩選抗VEGF單抗人源化12342011/1/186VEGF的表達與純化VEGF基因克隆VEGF蛋白表達鑒定VEGF為同源二聚體蛋白，在大腸桿菌中進行原核表達，目的蛋白為包涵體2011/1/187

DTA-VEGF8-110

表達與純化（抗原）VEGF的表達與純化VEGF165

的表達與純化純化得到的DTA-VEGF8-110

、VEGF165均能形成二聚體2011/1/188

VEGFR2胞外區(qū)在CHO細(xì)胞中與hGH融合表達

VEGFR2胞外區(qū)基因克隆VEGFR2胞外區(qū)表達與純化VEGFR2胞外區(qū)表達與純化2011/1/189hGH-VEGFR2包被ELISA板，測VEGF165與其結(jié)合活性hGH-VEGFR2與VEGF165結(jié)合活性測定VEGFR2胞外區(qū)表達與純化2011/1/1810hGH-VEGFR2與DTA-VEGF8-110結(jié)合活性測定DTA-VEGF8-110包被ELISA板，測hGH-VEGFR2與其結(jié)合活性VEGFR2胞外區(qū)表達與純化2011/1/1811目錄研究背景目的蛋白表達與純化抗VEGF鼠單抗制備及篩選抗VEGF單抗人源化12342011/1/1812DTA-VEGF8-110抗原免疫小鼠制備單克隆抗體，獲得19株VEGF特異性的單抗，其中3株單抗有阻斷作用單抗制備競爭抑制實驗

體外篩選MAb61為IgG1亞型，親和力4.5×10-9M2011/1/1814阻斷實驗MAb61對DTA-VEGF8-110與VEGFR2結(jié)合有明顯的阻斷競爭作用

圖A:Tris-Hclbuffer組；圖B:血管內(nèi)皮生長因子VEGF165(400ng)組；圖C:VEGF165(400ng)與MAb61(16μg)混合組；圖D:VEGF165(400ng)和VEGF不相關(guān)鼠源同型對照單抗MAbcontrol(16μg)組MAb61在體內(nèi)對VEGF的中和作用BCAD

雞胚尿囊膜實驗2011/1/1815用A673腫瘤細(xì)胞在裸鼠背部皮下接種建立腫瘤模型，腫瘤平均大小約100mm3時裸鼠隨機分為PBS、鼠源同型對照單抗MAbcontrol及MAb61三組，每組8只裸鼠，每只裸鼠每次腹腔注射100ug單抗或等體積PBS，一周兩次，治療5次。圖A：PBS對照組；圖B：MAbcontrol對照組；圖C：MAb61治療組MAb61抗腫瘤作用

腫瘤模型2011/1/1816治療結(jié)束時MAb61組小鼠腫瘤體積相比PBS組（P＜0.001）及MAbcontrol組（P＜0.001）均有顯著性差異，PBS組與MAbcontrol組（P＞0.05）無明顯差異；MAb61組小鼠腫瘤重量相比PBS組（P＜0.05）及MAbcontrol組（P＜0.05）均有顯著性差異，PBS組與MAbcontrol組（P＞0.05）無明顯差異；腫瘤體積和重量為means±s.e.m

腫瘤模型MAb61抗體對腫瘤的抑制作用2011/1/1817目錄研究背景目的蛋白表達與純化抗VEGF鼠單抗制備及篩選抗VEGF單抗人源化12342011/1/1818

鼠單抗可變區(qū)基因的克隆MAb61重鏈可變區(qū)PCR結(jié)果輕鏈可變區(qū)PCR結(jié)果

5’RACE

2011/1/1819嵌合抗體的表達及抗原結(jié)合活性

嵌合抗體嵌合抗體與抗原結(jié)合證明克隆得到的可變區(qū)基因正確2011/1/182024h48h72h陰性對照嵌合抗體表達水平測定（OD450）0.3050.4490.8780.158嵌合抗體抗原結(jié)合測定（OD450）0.7310.9061.2010.093Signal1與Signal2在48h、72h抗體的表達水平與Signal3比較均有顯著性差異（P＜0.001），Signal1與Signal2比較無顯著差異（P＞0.05）；Signal1為hGH信號肽，Signal2為帶有內(nèi)含子的抗體信號肽，Signal3為無內(nèi)含子的抗體信號肽；抗體表達濃度為mean±s.e.m。不同信號肽對抗體表達水平的影響

嵌合抗體2011/1/1821抗體人源化2011/1/1822紅色區(qū)域為重鏈CDR，綠色區(qū)域為輕鏈CDR，藍色區(qū)域為人源化位點鼠單抗可變區(qū)模型人源化單抗可變區(qū)模型MAb61VL為鼠源抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；Hum61VL為CDR移植后的抗體輕鏈可變區(qū)序列，與鼠源抗體相同的氨基酸未列出；#代表抗體CDR區(qū)；*對應(yīng)的位點為選擇的點突變位點。人源化抗體輕鏈可變區(qū)序列

抗體人源化2011/1/1823抗體人源化MAb61VH為鼠源體重鏈可變區(qū)氨基酸序列；Hum61VH為CDR移植后的抗體重鏈可變區(qū)序列，與鼠源抗體相同的氨基酸未列出；#代表抗體CDR區(qū)；*對應(yīng)的位點為選擇的點突變位點。人源化抗體重鏈可變區(qū)序列2011/1/1824

抗體人源化Hch：嵌合抗體重鏈；Lch：嵌合抗體輕鏈；Hhu：人源化抗體重鏈；Lhu：人源化抗體輕鏈

人源化抗體與抗原結(jié)合測定

結(jié)合實驗競爭實驗

人源化輕鏈對抗體的抗原結(jié)合能力影響較大2011/1/1825抗體人源化2011/1/1826紅色區(qū)域為重鏈CDR，綠色區(qū)域為輕鏈CDR，藍色區(qū)域為人源化位點鼠單抗可變區(qū)模型人源化單抗可變區(qū)模型

抗體人源化Hch：嵌合重鏈Lch：嵌合輕鏈Hhu：人源化重鏈Lhu：人源化輕鏈La：L58與L59雙點突變Lb：L71單點突變Lc：L58、59、71三點突變Ha：H28點突變Hb：H48點突變Hc：H66與H67雙點突變Hd：H71點突變輕鏈點突變重鏈點突變輕鏈選擇L58、L59；重鏈選擇H66、H67點突變恢復(fù)親和力2011/1/1827

抗體人源化Hch：嵌合抗體重鏈Lch：嵌合抗體輕鏈Hc：H66與H67雙點突變La：L58、L59雙點突變Ld：L58、L59及L38三點突變Le：L58、L59及L79三點突變Lf：L58、L59及L81三點突變Lg：L58、L59及L83三點突變H66、H67、L58、L59、L38位點突變后人源化抗體抗原結(jié)合能力接近嵌合抗體輕鏈點突變2011/1/1828人源化抗體抗腫瘤作用2011/1/1829A673細(xì)胞腫瘤模型體外親和力成熟

GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTXXXXXXXXXATGCACTGGGTGAAGCAAAGCCATGTAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACAAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAGCTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCAGCTTGACTGTAGATAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTGTTACTGTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGGCTXXXXXXXXTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA（VH序列）GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCACTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTGGAGCAAGTXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTAAATTGGTATCAGCGGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATXXXXXXXXXAACTTGGCAGATGGCATGTCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTAGACAGTATTCTCTCAAGATCAGTAGCCTGCATCCTGACGATGTTGCAACGTATTACTGTXXXXXXXXXXXXAGTAXXXXXXXXXXXTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC（VL序列）

Hotpot位點2011/1/1830體外親和力成熟突變位點2011/1/1831輕鏈突變Ser93Thr94位點；重鏈突變Gly96Tyr97位點體外親和力成熟2011/1/1832wildtype

61VLCDR3HotspotMutation大部分突變體親和力下降或喪失，部分突變體親和力有所提高體外親和力成熟2011/1/1833ProteOnXPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)（SPR）比較相對親和力體外親和力成熟2011/1/1834ForteBio’sOctetQK（BiolayerInterferometry）比較相對親和力體外親和力成熟輕鏈突變體氨基酸WildtypeSerThr256-8HisThr256-9AsnThr256