兩種不同種內(nèi)雜交組合的胚胎發(fā)生及生長發(fā)育分析_第1頁
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兩種不同種內(nèi)雜交組合的胚胎發(fā)生及生長發(fā)育分析

首席演員和首席演員c.nobilis,同一主題的扇骨。第一種是一種寒冷的溫帶品種,主要分布在中國。它是中國北方沿海扇動物的主要品種。后者是一種溫帶型,主要分布在廣東、廣東和福建沿海地區(qū)。兩種扇貝生活海區(qū)不同,生態(tài)習(xí)性各異,具有很強的互補性。以櫛孔扇貝作母本、華貴櫛孔扇貝作父本雜交獲得的一系列品系存在明顯的雜種優(yōu)勢,在諸性狀上均不同程度地表現(xiàn)優(yōu)于雙親的特點。利用該遠(yuǎn)緣雜交技術(shù),結(jié)合選擇育種策略,作者培育了扇貝養(yǎng)殖新品系“蓬萊紅”,其在外觀、抗逆性和生長速率上均表現(xiàn)出很強的雜種優(yōu)勢。王偉等(2003)報道了該品系的試養(yǎng)技術(shù),初步建立了其海上養(yǎng)成的主要技術(shù)體系。然而,櫛孔扇貝和華貴櫛孔扇貝在分類學(xué)上為兩個不同的種,其染色體數(shù)目也不同,前者2n=38,后者2n=32,遺傳上屬于兩個遠(yuǎn)緣扇貝種,二者雜交過程中如何保持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性還是一個謎。在實際的生產(chǎn)試驗過程中,作者也發(fā)現(xiàn)兩個物種雜交存在一定的生殖隔離現(xiàn)象,表現(xiàn)為不同群體或不同個體間雜交胚胎發(fā)生過程中受精、孵化受抑,幼蟲生長狀況不穩(wěn)定、變態(tài)率偏低??梢哉f,兩個扇貝種雜交后代的胚胎發(fā)生過程及幼蟲期的生長和附著、變態(tài)是其在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的主要瓶頸。利用具有良好配合力的群系雜交是生產(chǎn)上急需解決的問題,本文中選擇櫛孔扇貝的兩個地理種群(長島群體和膠南群體)與華貴櫛孔扇貝(采自福建沿海)雜交,對獲得的兩個種間雜交組合HCH和HJH進行觀察計量。以櫛孔扇貝的種內(nèi)交配組ZZ為對照,分析種間雜交子代的受精率、孵化率及附著變態(tài)率,D形幼蟲的殼長、高的動態(tài)過程,旨在探明櫛孔扇貝屬兩個不同種存在生殖隔離的程度,全面評價櫛-華雜交體系(櫛孔扇貝×華貴櫛孔扇貝)的應(yīng)用前景和價值,為優(yōu)良雜交組合的篩選提供理論依據(jù)。1測試1.1試驗過程和主要設(shè)計1.1.1島膠東南角區(qū)域櫛孔扇貝包括兩個地理群體,分別采自煙臺長島海區(qū)和青島膠南海區(qū)(稱櫛孔扇貝長島群體和膠南群體),華貴櫛孔扇貝采自福建沿海。以上試驗材料分別于2004年3月上旬運至煙臺開發(fā)區(qū)常飛海珍品有限公司扇貝育苗車間暫養(yǎng)。1.1.2餌料的投喂實驗親貝入池水溫與其來源海區(qū)當(dāng)時水溫大致相當(dāng),而后每日升溫0.5℃,最后恒溫在(14.5±0.5)℃,進行性腺促熟。促熟期間投喂優(yōu)質(zhì)微藻餌料,投喂間隔時間為2h,并每天洗池、換水一次。4月1日,根據(jù)性腺顏色區(qū)分雌、雄,性腺顏色不明顯的個體予以剔除置于它池暫養(yǎng)。通過區(qū)分和挑選獲得櫛孔扇貝長島群體雌、雄親貝,膠南群體雌、雄親貝和華貴櫛孔雌、雄親貝分池繼續(xù)暫養(yǎng)促熟。1.1.3群體混合的精子檢測4月5日,對實驗所需親貝進行陰干刺激30min后,將櫛孔扇貝長島群體和膠南群體雌貝置于兩個不同的育苗池中升溫刺激產(chǎn)卵,櫛孔扇貝兩個地理群體雄貝混合置于盆1中排精,華貴櫛孔雄貝置于盆2中排精,刺激產(chǎn)卵、排精的水溫均為18℃。各雌、雄貝均先后產(chǎn)卵、排精后,將櫛孔扇貝兩個群體的雌貝取出置于另一育苗池中繼續(xù)產(chǎn)卵,在櫛孔孔扇貝長島群體和膠南群體的產(chǎn)卵池中加入適量華貴櫛孔扇貝的精子,在兩群體混合產(chǎn)卵池中加入櫛孔扇貝的混合精子,顯微鏡檢每個卵子周圍4—6個精子。由此獲得2個櫛-華雜交組合的子代(分別稱HCH和HJH)和1個櫛孔扇貝種內(nèi)交配子代ZZ,供試驗取樣觀察與分析。1.1.4幼蟲培養(yǎng)和飼養(yǎng)授精后30h,大部分幼蟲發(fā)育到D形幼蟲期。用300目篩絹進行幼蟲選優(yōu)并移入預(yù)先備好新鮮海水幼蟲培養(yǎng)池中池中起始水溫調(diào)節(jié)在18℃左右,兩天內(nèi)緩慢升溫到20℃,并恒定在此溫度下并進行幼蟲培養(yǎng)。幼蟲培養(yǎng)密度為10個/ml左右。培養(yǎng)期間投喂新鮮叉鞭金藻餌料,投喂頻率為每2h一次。海水每天更換兩次,換水量為2/3。每兩天進行一次倒池排除池中積累殘余餌料和糞便。幼蟲培養(yǎng)至15日齡眼點幼蟲達(dá)一定比例適時投放網(wǎng)繩附著基供其及時附著變態(tài)。1.2屬性觀察與測定1.2.1計數(shù)受精率以排出第一極體為受精成功的統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn),用顯微鏡分別于授精后15、20、25min三個時間點計數(shù)受精率(王如才等,1993)。采用五點取樣的方法,每點取樣水體約100ml,用300目的篩絹富集并分別計數(shù)即重復(fù)5次(各點觀察個體數(shù)超過200粒,以下各性狀取樣方法均同)。1.2.2幼蟲孵化時間以胚胎發(fā)育至破卵膜,能夠旋轉(zhuǎn)運動即擔(dān)輪幼蟲階段為成功孵化的統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn),用顯微鏡分別于授精20、21、22h三個時間點計數(shù)胚胎孵化率(王如才等,1993)。1.2.3幼蟲d發(fā)生率的測量1.2.4幼蟲殼長、高取樣櫛孔扇貝的兩個地理群體的卵,用帶目微尺的顯微鏡測量其直徑大小,每個群體隨機測量50粒卵。D形幼蟲達(dá)2日齡后,每日(取樣至8日齡)定時取樣三個組合D形幼蟲并用顯微鏡測量其殼長、高,含2、3、5、6、7、8日齡共6次D形幼蟲觀察結(jié)果(4日齡計量結(jié)果無效)。各期將五點取樣水體混合,隨機測量50粒個體。1.2.5眼點昆蟲的計數(shù)和大小測量幼蟲達(dá)13、14、15日齡時分別計數(shù)各組合眼點幼蟲的比例。用顯微鏡隨機測量50個15日齡幼蟲(五點取樣混合)長和高。1.2.6關(guān)于幼蟲變態(tài)的觀察在幼蟲達(dá)20、25、30日齡時分別剪取附著網(wǎng),洗出附著幼蟲,觀察變態(tài)幼蟲比例。1.3單株組合間的雜交分析采用的Excel統(tǒng)計分析工具庫程序計算各性狀均值和標(biāo)準(zhǔn)差,并繪制柱狀圖或折線圖。應(yīng)用SAS8.2軟件的GLM(廣義線性模型)過程(阮貴海等,2003)編寫SAS程序,對三個組合的受精率、孵化率、D形幼蟲發(fā)生率、D形幼蟲生長、眼點幼蟲率、變態(tài)率等性狀進行單一自由度的方差分析(莫惠棟,1992),測驗櫛-華雜交F1與種內(nèi)交配子代、兩個種間雜交組合之間的差異顯著性。2結(jié)果與分析2.1胚胎出生2.1.1出精率差異授精后3個時刻觀察統(tǒng)計的受精率結(jié)果列于表1。由表1可以看出,兩個櫛-華雜交組合的F1的受精時間大多相對ZZ組合推遲,最終(授精后25min時)觀察到的成功受精率也相對偏低。對該時刻的受精率進行單一自由度的方差分析(表2),結(jié)果表明雜交組合F1的受精率與種內(nèi)交配組合子代存在極顯著差異,均表現(xiàn)為顯著低于ZZ組合。組合HCH和HJH的受精率也顯著不同,F測驗值(25.91)達(dá)到了極顯著水平,即HCH的受精率顯著高于HJH。2.1.2雜交組合hjh的孵化表1中同時列出了兩個雜交組合和櫛孔扇貝種內(nèi)交配組合的孵化率觀察結(jié)果的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。由表中結(jié)果看出,授精后20h,ZZ組合的孵化率即達(dá)到了80.2%,而同期HCH和HJH的孵化率分別只有40.4%和29.5%。授精后22h的孵化率統(tǒng)計結(jié)果表明,雜交組合雖孵化較慢,但也能達(dá)到很高的比率,其中組合HJH的孵化率達(dá)到了95.8%,與ZZ組合(96.1%)相當(dāng)接近。表2列出了授精后22h孵化率的方差分析結(jié)果。雜交組合的孵化率同樣顯著有別于櫛孔扇貝種內(nèi)交配組合,但這種差別主要來自于HCH組合。兩個雜交組合之間的測驗結(jié)果也表明,HCH組合的孵化率極顯著低于HJH組合。2.2d昆蟲的發(fā)生和生長2.2.1zz與d形幼蟲的關(guān)系圖1給出櫛-華雜交組合HCH、HJH和種內(nèi)交配組合ZZ的D形幼蟲發(fā)生率結(jié)果的圖示。從圖中結(jié)果可以看出,兩個雜交組合的D形幼蟲發(fā)生與ZZ組合能基本保持同步,授精后29h,兩個雜交組合D形幼蟲發(fā)生率均達(dá)到了較高水平。對授精后30h的D形幼蟲發(fā)生率作單一自由度的方差分析,結(jié)果列于表3,可以看出,ZZ組合的D形幼蟲發(fā)生率仍顯著高于雜交組合,而兩個雜交組合之間的差別不明顯(F=3.96ns)。2.2.2u3000沒有同時進行雜合性實驗表4中記錄了櫛-華雜交組合和櫛孔扇貝種內(nèi)交配組合2—8日齡D形幼蟲的平均殼長、高的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表中數(shù)據(jù)可以看出,2日齡時ZZ組合的殼長最大,達(dá)108.4μm,HJH次之,HCH最小,為105.0μm。7日齡時兩個雜交組合的殼長、高均超過了ZZ組合。8日齡的HJH組合的平均大小達(dá)143.4μm×123.2μm,HCH組合的平均大小達(dá)139.2μm×119.0μm,均較ZZ組合的(136.8μm×117.0μm)大,雜種的生長優(yōu)勢已初步得到顯示。從表4中還發(fā)現(xiàn),ZZ組合幼蟲殼性狀的變異度(標(biāo)準(zhǔn)偏差)普遍較雜交組合偏大,說明試驗中采用的野生櫛孔扇貝群體高度雜合,個體之間的生長發(fā)育差異較大。種間雜交組合個體間生長所以差異較小,可能是由于雜種優(yōu)勢部分地掩蓋了其雜合多樣性。對HCH、HJH、ZZ組合2日齡和8日齡殼長、高進行單一自由度的方差分析。統(tǒng)計結(jié)果表明,種間雜交組合HCH、HJH2日齡、8日齡殼長、高性狀均顯著或極顯著不同于ZZ組合(表5)。結(jié)合表4,雜交組合在該性狀上呈現(xiàn)前低后高的特點,說明種間雜交子代的生長快于櫛孔扇貝種內(nèi)交配組合,存在一定雜種優(yōu)勢。測驗的結(jié)果還表明兩個雜交組HCH和HJH也顯著不同,這種差別在D形幼蟲生長期內(nèi)保持較好的一致性,即組合HJH大于HCH。為研究這種效應(yīng)和差別是否受到兩個地理群體的櫛孔扇貝群體卵子大小的影響,試驗隨機觀察測定50粒卵子的直徑,并作統(tǒng)計測驗,結(jié)果列于表6。櫛孔扇貝長島群體雌貝卵子直徑平均為68.33μm,膠南群體為69.50μm,t測驗結(jié)果表明兩者無明顯差異。故可初步推斷兩者在D形幼蟲生長上的差異主要是因于櫛孔扇貝不同地理群體的遺傳分化所致。2.3眼點幼蟲發(fā)生率眼點的出現(xiàn)是幼蟲即將附著變態(tài)的信號特征,生產(chǎn)上將之作為投放附著基的標(biāo)志,在眼點幼蟲出現(xiàn)率達(dá)30%—40%時投放附著基(王如才等,1993)。所以研究眼點幼蟲的發(fā)生情況非常重要。表7列出了受精后13天、14天、15天HCH、HJH、ZZ的眼點幼蟲發(fā)生情況,同時記錄了15日齡的殼長、殼高兩種性狀的大小。從表7可以看出,14日齡ZZ的眼點出現(xiàn)率即達(dá)41.2%,15日齡達(dá)59.0%,同期兩個種間雜交組合眼點幼蟲發(fā)生率較低,15日齡時HCH為38.1%,HJH為40.3%。雜交組合15日齡眼點幼蟲平均規(guī)格HCH為173.2μm×153.6μm、HJH為173.2μm×154.8μm,大于ZZ組合。15日齡的眼點幼蟲發(fā)生率的方差分析結(jié)果表明,兩個雜交組合的眼點幼蟲發(fā)生較一致,其發(fā)生比例均低于ZZ組合,并達(dá)到極顯著水平(表8),生產(chǎn)上應(yīng)酌情推遲投放附著基的時間。2.4不同年齡組合hch的變異性分析HCH、HJH、ZZ三組合幼蟲變態(tài)率差異,利用均值和標(biāo)準(zhǔn)差繪制折線圖,得圖2。雜交組合的變態(tài)率普遍低于ZZ組合,20日齡時組合HCH很少發(fā)生變態(tài),比例僅為5.4%。30日齡當(dāng)ZZ組合平均變態(tài)率達(dá)86.2%時,雜交組合HCH僅為42.0%,HJH相對較好,可達(dá)到61.5%。方差分析結(jié)果(表9)再次表明,雜交組合的變態(tài)率極顯著低于櫛孔扇貝種內(nèi)交配組合,F測驗值達(dá)374.03,在變態(tài)率性狀上,組合HJH明顯優(yōu)于HCH組合。3討論3.1牡蠣種內(nèi)、種間雜交雜交育種是進行動、植物遺傳改良的重要手段和有效方法,雜種優(yōu)勢是一種普遍的生物現(xiàn)象。在農(nóng)作物及畜禽生產(chǎn)與試驗中,育種家通過種內(nèi)遠(yuǎn)緣雜交和種間雜交培育出大量優(yōu)勢雜種品種。近些年來雜交育種的理論和方法也較廣泛應(yīng)用到海洋貝類的遺傳改良和育種實踐中。Scarpa(1992)、Allen等(1993)報道過牡蠣種內(nèi)、種間雜交的雜種表現(xiàn),大多雜種牡蠣在生長率、抗逆性等方面存在雜種優(yōu)勢。在扇貝中,Heath(1995)通過對2種扇貝(Patinopectenyessoensis和P.canrinus)進行雜交育種成功地培育出一抗病品系。最近幾年,我國引進日本盤鮑,與我國的皺紋盤鮑雜交獲得的雜交鮑在產(chǎn)業(yè)中表現(xiàn)出生長快,存活率高等優(yōu)點,給養(yǎng)殖單位和廣大養(yǎng)殖戶帶來很好的經(jīng)濟效益,已經(jīng)受到人們的關(guān)注(包振民等,2002)。在國家高技術(shù)863課題的資助下,由本研究室篩選獲得的櫛孔扇貝×華貴櫛孔扇貝雜交組合,在連續(xù)幾年的生產(chǎn)試驗中,雜交一代在海上養(yǎng)成階段均表現(xiàn)出耐高溫、生長快的特點,并且雜交后代是可育的,能夠通過進一步同胞交或回交,固定一些目標(biāo)性狀。關(guān)于櫛孔扇貝×華貴櫛孔扇貝組合雜交發(fā)生的遺傳學(xué)機理還有待進一步探明。3.2采用短流程帶動小體粉組合的雜交發(fā)育種間雜交突破了種間生殖隔離的影響,但也均普遍表現(xiàn)受精困難、時間上滯緩等特點,或者在雜種的育性上存在問題。櫛孔扇貝和華貴櫛孔扇貝為同屬的兩個不同種,兩者的染色體數(shù)目也不同。本文研究結(jié)果表明,櫛孔扇貝×華貴櫛孔扇貝組合F1的胚胎發(fā)生和幼蟲附著、變態(tài)均存在一定的阻遏現(xiàn)象,普遍表現(xiàn)為受精率、孵化率和變態(tài)率等低于櫛孔扇貝種內(nèi)交配組合。一旦突破生殖隔離,其生長的優(yōu)勢也是顯著的,D形幼蟲期即表現(xiàn)出殼長、高的增長快于ZZ組合的特點??梢?櫛孔扇貝和華貴櫛孔扇貝的種間雜交F1在生長和發(fā)育的兩個環(huán)節(jié)上是不一致的,在涉及器官及其功能形成的發(fā)育環(huán)節(jié)上,雜交表現(xiàn)負(fù)效應(yīng);而在涉及形態(tài)變化和增大的生長環(huán)節(jié)上,雜交表現(xiàn)正效應(yīng),存在雜種優(yōu)勢現(xiàn)象。3.3采用同工酶技術(shù)分析的遺傳多樣性野生扇貝是高度雜

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