反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系研究的回顧與展望

反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系研究的回顧與展望

反芻動(dòng)物瘤胃有幾種復(fù)雜、多樣和不受影響的微生物，如腫瘤細(xì)菌、厭氧菌和纖毛蟲，以及少量寄生蟲。幼畜出生前，其消化道內(nèi)并無微生物，出生后從母體和環(huán)境中接觸各種微生物，但是經(jīng)過選擇，只有少數(shù)微生物能在消化道定植、存活和繁殖，并隨著幼畜的生長(zhǎng)和發(fā)育，形成特定的微生物區(qū)系。因此，反芻動(dòng)物瘤胃選擇了其特定的微生物區(qū)系，這些微生物選擇了瘤胃的環(huán)境，這種選擇最典型的例子是只有反芻動(dòng)物和單胃草食動(dòng)物消化道才有厭氧真菌。研究瘤胃微生物的目的，是為了了解它們的形態(tài)、生理、繁殖、分布、種群之間相互制約及與宿主間的相互依賴關(guān)系。近年來通過反芻動(dòng)物胃腸瘺管技術(shù)，瘤胃微生物的分離、培養(yǎng)和分子生物學(xué)研究以及瘤胃生態(tài)的人工模擬等技術(shù)，希望更多地掌握瘤胃代謝和微生物相互之間的關(guān)系，為合理應(yīng)用飼料，開辟新的飼料資源提供幫助。1瘤胃纖毛蟲的形態(tài)、生理和區(qū)系劃分的研究從1843年Gubry和Delaford在反芻動(dòng)物的瘤胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)微生物時(shí)起，一直延續(xù)到20世紀(jì)初，由于受到研究條件和技術(shù)的限制，許多研究者主要從事形態(tài)、分類的研究工作（Hungate,1966）。我國學(xué)者熊大仕早在20世紀(jì)30年代就開始這方面的研究，尤其對(duì)瘤胃纖毛蟲的形態(tài)和分類進(jìn)行了許多研究。1940年以后，瘤胃微生物在宿主內(nèi)的消化作用才被證實(shí)。1948年，英國學(xué)者Elsden和Pillpson基于動(dòng)物生理的研究，闡明了在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中微生物發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸的重要性。同一時(shí)期，Hungate等人在瘤胃微生物的形態(tài)、生理以及區(qū)系劃分等方面做出了很大貢獻(xiàn)。20世紀(jì)70年代以來，電子顯微鏡在微生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用使人們更深入地了解到微生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，并使過去在微生物系統(tǒng)分類方面存在的許多分歧得到了很好的解決。2新技術(shù)的應(yīng)用近年來，隨著各種技術(shù)的不斷進(jìn)步，反芻動(dòng)物胃腸瘺管技術(shù)，瘤胃微生物的分離、培養(yǎng)和分子生物學(xué)研究以及瘤胃生態(tài)的人工模擬技術(shù)，瘤胃微生物發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，基于核糖體RNA為主的分子生物學(xué)技術(shù)等也得到了迅猛發(fā)展，這樣就加快了環(huán)境生態(tài)下微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的研究，一些不能培養(yǎng)的原來未知的微生物被發(fā)現(xiàn)，如大型瘤胃細(xì)菌Quinellaovalis從未培養(yǎng)成功，但經(jīng)過核糖體RNA小亞基的基因序列分析而被確定分類地位（Krumholz等,1993）。同時(shí)，也可用這些新技術(shù)重新認(rèn)識(shí)已知微生物。下面介紹幾種分子生物學(xué)技術(shù)在瘤胃微生物多樣性及分子生態(tài)學(xué)方面的研究進(jìn)展。2.1srrna擴(kuò)增核糖體RNA(rRNA)是生物在進(jìn)化過程中很保守的大分子，因此可用作各類生物進(jìn)化分類的依據(jù)。核糖體RNA分子有兩種，細(xì)菌有小亞基（smallsubunitsuu）的16SrRNA和大亞基的5SrRNA、23SrRNA；真菌有小亞基18SrRNA和大亞基的5SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA。5SrRNA分子序列短，提供信息少，不適宜于生物分類。雖然23SrRNA和28SrRNA序列較長(zhǎng)，可提供更多的信息，能更準(zhǔn)確地研究系統(tǒng)發(fā)育分類及鑒定菌株，但是由于基因數(shù)據(jù)庫中有關(guān)信息較少，難以進(jìn)行比較分析。所以，用于研究細(xì)菌進(jìn)化分類的通常是在基因數(shù)據(jù)庫中注冊(cè)數(shù)量較多的16SrRNA，對(duì)真菌則用18SrRNA。核糖體RNA分子可分為保守區(qū)和可變區(qū)，如細(xì)菌的16SrRNA有9個(gè)可變區(qū)。保守區(qū)可用作通用PCR的引物或可制成基因探針進(jìn)行分子雜交和大類微生物（如古細(xì)菌、細(xì)菌和真核生物）的鑒別，如細(xì)菌固有的保守區(qū)可制成細(xì)菌的通用引物對(duì)部分或全部16SrRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。可變區(qū)可制成選擇性或?qū)Ｒ恍砸锘蛱结樳M(jìn)行屬、種甚至株系的區(qū)分。這種技術(shù)采用的可以直接是rRNA也可以是rDNA，即編碼rRNA的基因，其基本過程是，先提取微生物的總DNA或RNA，然后通過引物或探針，對(duì)rRNA某變化區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列分析或進(jìn)行分子雜交，從而對(duì)微生物進(jìn)行鑒別和系統(tǒng)發(fā)育上的分類。2.2微生物區(qū)系的研究16SrRNA方法的理論和實(shí)際操作前人已有大量的報(bào)道，研究者完善地建立了利用小亞基rRNA———16SrRNA研究胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)的方法。這種方法也適用于23SrRNA,由于其信息量很大(3000bp)，故在技術(shù)更為成熟時(shí)，能得到更為廣泛的應(yīng)用。16SrRNA保守區(qū)的互補(bǔ)寡核苷酸可用來設(shè)計(jì)通用探針,而其可變區(qū)則用來設(shè)計(jì)成高特異性的探針,用來鑒定微生物的屬或種,乃至某一菌株。Ogata等（1997）利用16SrRNA寡核苷酸探針研究牛瘤胃中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)和多毛毛螺菌(Lacbnospiramultiparus)的數(shù)量與變化及其在復(fù)雜的微生物區(qū)系中的活性,結(jié)果表明,相關(guān)種的F.succinogenes具有遺傳多樣性，在該試驗(yàn)中,傳統(tǒng)的培養(yǎng)計(jì)數(shù)法沒有獲得成功。群特異性的16SrRNA寡核苷酸探針可以用來研究不同家畜(牛、綿羊、山羊、豬)胃腸道中細(xì)菌、真核生物和古細(xì)菌的數(shù)量,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這三類微生物數(shù)量的變化范圍分別為60%～90%、3%～30%和0.5%～3%，且發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物消化道中占優(yōu)勢(shì)的甲烷菌是不同的。Krause和Russell(1996)利用探針研究了莫能霉素添加水平對(duì)瘤胃中氨基酸利用率及其脫氨基作用的影響,探針還被用于白色瘤胃球菌(Ruminlcoccusalbus)和黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)在發(fā)酵纖維二糖、纖維素及堿處理麥秸時(shí)細(xì)菌間相互關(guān)系的動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果表明,16SrRNA寡核苷酸探針能有效地鑒定培養(yǎng)物中特定的細(xì)菌,而且還能提供細(xì)菌間競(jìng)爭(zhēng)作用的一些信息。這些探針還被用來研究R.albus、R.flavefaciens和F.succinogenes在底物充足或不足的環(huán)境中對(duì)纖維二糖和纖維素的競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象。黃慶生等利用探針研究了酵母培養(yǎng)物對(duì)瘤胃細(xì)菌的影響,發(fā)現(xiàn)添加酵母培養(yǎng)物能顯著提高黃色瘤胃球菌的相對(duì)比例。Finlay等利用熒光標(biāo)記的16SrRNA寡核苷酸探針研究了瘤胃中的古細(xì)菌,證實(shí)內(nèi)毛亞科(Entodinium)和反芻厚毛蟲(Dasytricharuminantium)的細(xì)胞液泡外含有內(nèi)共生的甲烷菌。Sharp等（1998）利用SSUrRNA探針研究瘤胃和體外連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中的微生物區(qū)系,均發(fā)現(xiàn)原蟲和產(chǎn)甲烷菌之間有很強(qiáng)的互作關(guān)系。甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)是瘤胃古細(xì)菌中最大的一類,占89.13%,而且在99.12%的原蟲碎片中均有發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)48h后,隨著原蟲數(shù)量的下降,甲烷桿菌科菌占古細(xì)菌的比例降為54%,但占古細(xì)菌12.11%的甲烷微菌科(Methanomicrobiale)細(xì)菌在原蟲碎片中沒有檢測(cè)到,這說明甲烷微菌科細(xì)菌是游離在原蟲外的。2.31藥血生化指標(biāo)運(yùn)用PCR技術(shù)可以檢測(cè)各種環(huán)境中的細(xì)菌，其靈敏度足以檢測(cè)單個(gè)細(xì)菌。競(jìng)爭(zhēng)PCR，即在PCR反應(yīng)中再加入DNA內(nèi)標(biāo)，可進(jìn)行定量分析。Reilly和Attwood(1998）利用16SrRNA基因的PCR研究了不同日糧條件下荷斯坦泌乳奶牛瘤胃中蛋白降解梭菌Clostridiumproteoclasticum的數(shù)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌在瘤胃中受日糧的影響不大，其數(shù)量在2.01×106～3.12×107個(gè)/ml之間變化。Koike和Kobayashi(2001）用特異性的競(jìng)爭(zhēng)PCR分析比較了消化道食糜和純培養(yǎng)中瘤胃纖維細(xì)菌數(shù)量計(jì)數(shù)的靈敏度。在純培養(yǎng)條件下，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌的最低檢測(cè)水平為1～10個(gè)細(xì)菌，而培養(yǎng)瘤胃食糜情況下，這些菌的最低檢測(cè)水平為103～104個(gè)/ml。這三種纖維細(xì)菌在瘤胃和瓣胃中最多，皺胃和后腸中也能檢測(cè)到，其中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量在消化道不同部位均為三者最高。一般認(rèn)為，競(jìng)爭(zhēng)PCR是一種快速、可靠的定量方法，而其靈敏性與16SrDNA探針特異性的結(jié)合更能對(duì)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌群體數(shù)量進(jìn)行定量檢測(cè)。2.4srdna基因克隆隨著基因克隆及PCR技術(shù)的迅速發(fā)展,核糖體RNA基因序列分析成為可能,從而促進(jìn)了對(duì)復(fù)雜的微生物系統(tǒng)進(jìn)行研究。目前，這種從16SrRNA基因的克隆、序列分析到系統(tǒng)發(fā)育分析的技術(shù)為環(huán)境微生態(tài)的研究提供了一條有效的途徑。這種方法過去主要用于純菌的鑒定上，為微生物的分類提供了可靠信息。近年來，被廣泛地應(yīng)用到腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的分析,目前有白蟻腸道、人類結(jié)腸和糞樣微生物方面的研究（Okhuma和Kudo,1996;Wilson和Blitchington,1996）。Whitford等（1998）從飼喂全混合日糧(26%苜蓿、30%青貯玉米和35%精料)的奶牛瘤胃液中制備了兩個(gè)基因克隆庫,通過分析發(fā)現(xiàn)，133個(gè)序列中有101個(gè)與瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)是同源的,但大部分是以前從未培養(yǎng)或分離成功的細(xì)菌。Tajima等從飼喂全混合日糧牛的瘤胃液相、固相和飼喂高粗料(苜蓿、貓尾草)的瘤胃液中制備了16SrDNA基因克隆庫,通過分析(161個(gè)克隆)發(fā)現(xiàn)，只有10個(gè)序列(6.12%)與已知的細(xì)菌一致34.16%的序列與已知細(xì)菌具有90%～98%的同源性,其余的與現(xiàn)在已知細(xì)菌的同源性均小于90%。與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果相反,體外培養(yǎng)得到的細(xì)菌與現(xiàn)在已知的細(xì)菌高度一致。Koike等（2001）利用該技術(shù)研究了綿羊瘤胃中附著在鴨茅和苜蓿稈上的微生物區(qū)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)91個(gè)克隆中有38個(gè)克隆與已知的細(xì)菌同源性低于90%。這些試驗(yàn)表明，有很多微生物在體外培養(yǎng)不能成活,從而得不到徹底的研究。目前利用該方法研究瘤胃中的原蟲和真菌還不如細(xì)菌深入和成熟。Embley等（1995）通過分析多泡多甲蟲(Polyplastronmultivesiculatum)和D.ruminantium的18SrRNA序列,對(duì)其進(jìn)行了分類。Dore和Stahl(1991）通過對(duì)18SrRNA序列的分析和比較,將Neocallimastix屬分類于壺菌綱(Chytridiomycete)；研究者還對(duì)四種瘤胃真菌進(jìn)行了18SrRNA序列分析,數(shù)據(jù)與前人研究結(jié)果一致,而且還發(fā)現(xiàn)瘤胃真菌也具有同源性。以上研究發(fā)現(xiàn)了一些新的有用信息,但也有一些問題需要得到解決。這些問題主要體現(xiàn)在核酸的抽提、PCR及克隆過程中所產(chǎn)生的一些偏差和假象。例如,在數(shù)據(jù)庫的建立過程中,由于檢測(cè)手段的限制,將一些人工合成的序列錄入了數(shù)據(jù)庫,從而導(dǎo)致樣品的基因克隆庫和凝膠電泳圖譜很難分析，甚至得出錯(cuò)誤的結(jié)果。2.5電泳圖譜分析雖然16SrDNA（或RNA）基因序列分析方法為微生態(tài)研究提供可靠的信息，但是由于克隆數(shù)量要求大，基因序列分析費(fèi)時(shí)且成本高，因此不適用于如瘤胃這樣復(fù)雜的微生態(tài)的研究，尤其是微生物區(qū)系變化規(guī)律的檢測(cè)。近年來，DNA指紋技術(shù)（fingerprintingtechniques）迅速發(fā)展，變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）和溫度梯度凝膠電泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)技術(shù)受到微生態(tài)研究者的關(guān)注，為研究菌群結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化提供了有效的手段。1993年Muyzer等首次將遺傳指紋技術(shù)引入微生物生態(tài)學(xué)研究中，利用DGGE研究了環(huán)境中微生物區(qū)系的變化。利用DGGE和TGGE技術(shù)可以將長(zhǎng)度相同但序列不同的DNA片段分開,其原理是在線性梯度變性或線性溫度變性的聚丙烯酰胺凝膠上,DNA雙鏈分子會(huì)逐步解鏈,遷移率也隨之下降。DNA序列不一樣,其解鏈的溫度和所需的變性濃度也不一樣,最終各種不同的DNA片段會(huì)在凝膠上呈現(xiàn)不同的條帶,然后通過EB、SYBRGreenI或銀離子染色即可成像,進(jìn)而進(jìn)行分析,通過對(duì)電泳圖譜的直接分析可以對(duì)微生態(tài)系統(tǒng)中的各種細(xì)菌進(jìn)行相對(duì)定量。該技術(shù)已經(jīng)廣泛地用來研究復(fù)雜的環(huán)境微生態(tài)系統(tǒng)、監(jiān)測(cè)其區(qū)系組成變化、分離細(xì)菌、比較各種DNA抽提方法的效率以及檢測(cè)PCR和克隆過程中產(chǎn)生的偏差等。但由于腸道系統(tǒng)中微生物種類繁多,產(chǎn)生的條帶也多,而且很復(fù)雜,會(huì)對(duì)分析造成很大的困難,這在一定程度上限制了該技術(shù)在腸道生態(tài)系統(tǒng)上的應(yīng)用。Cann等（1996）利用該方法純化了瘤胃液中的纖維素利用菌F.succinogenes、R.albus和R.flavefaciens。DGGE圖譜顯示，R.flavefaciens9個(gè)菌株的16SrRNA的V3區(qū)經(jīng)過PCR擴(kuò)增后,在凝膠上處于同一個(gè)位置,這表明R.flavefaciens的16SrRNA的V3區(qū)沒有多樣性；R.albus則相反,9種菌株的該區(qū)呈現(xiàn)出高度的多樣性。Ruminococcus兩個(gè)種的電泳圖譜與F.succinogenes有很大的不同,在電泳圖譜上,可以很容易地將F.succinogenes、R.albus和R.flavefaciens的PCR產(chǎn)物區(qū)分開。這表明,DGGE可以將分類相近的菌株進(jìn)行分離,故該技術(shù)可以用來分析瘤胃液中纖維素利用菌的多樣性及其動(dòng)態(tài)變化。Kocherginsdaya等（1997）利用該技術(shù)分析了飼喂不同日糧肉牛的瘤胃液微生物區(qū)系，提取總?cè)旧wDNA,擴(kuò)增16SrDNA的V3或V9區(qū),結(jié)果發(fā)現(xiàn),飼喂干草日糧的肉牛其圖譜相似，共出現(xiàn)了16條明顯的帶,其中5條占優(yōu)勢(shì),但飼喂精料為主的結(jié)果與前者不同,每頭牛的圖譜都不一樣。Zhu等（2001）利用DGGE分析了斷奶仔豬糞樣體外培養(yǎng)甜菜渣時(shí)細(xì)菌區(qū)系的變化情況,發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)后,DGGE圖譜的電泳條帶會(huì)出現(xiàn)3條優(yōu)勢(shì)條帶,通過16SrDNA的序列分析,這3種菌中兩種與挑剔真桿菌(Eubacteriumeligens)和裂果膠毛螺菌(Lachnospirapectinoschiza)具有92%和96%的同源性,另外一