原油和油田產(chǎn)水中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究

原油和油田產(chǎn)水中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究

特別是在那些使用注水法提高原油產(chǎn)量的油田中，有一些厭氧微生物群落。這些細(xì)菌的來源,也就是說它們是本來存在于油田里的還是由注水引入的,目前還不能完全分辨出來。因為微生物會影響儲存原油的質(zhì)量,比如硫酸鹽還原菌產(chǎn)生的硫化物具有毒性和腐蝕性,而且硫化物可能會生成不溶性的金屬硫化物,這些不溶性的金屬硫化物會造成油儲層滲透率的損失。此外,一些微生物還有缺氧氧化石油烴的能力,這些因素都會對石油工業(yè)造成很大的損失。為了抑制油藏中的細(xì)菌活性,在石油生產(chǎn)中人為加入一些細(xì)菌抑制物質(zhì),這些物質(zhì)包括:氧化性和非氧化性的殺菌劑(氯、溴、醛)以及季鏻鹽類等。近期有文章稱:通過在回注水中加入硝酸鹽(或亞硝酸鹽或硝酸鹽亞硝酸鹽的混合物)和引入硝酸鹽還原菌、硫化物氧化菌的方法對抑制硫化物積累很有效。在石油工業(yè)中,很難估計由微生物(SRB和其他細(xì)菌)作用導(dǎo)致管道腐蝕而造成的經(jīng)濟(jì)損失。有研究者報道,當(dāng)只用殺菌劑來控制微生物的活性時,每個井臺用于控制SRB的活性每年大約需花費150000美元。所以,研究油田環(huán)境中的微生物群落分布和多樣性非常重要。但是,迄今為止,對遠(yuǎn)距離石油集輸系統(tǒng)中的微生物群落的研究存在空白。在石油微生物學(xué)中,也有應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)來分析油藏和油田中的微生物群落。但是,在這些研究中用于PCR擴(kuò)增的DNA不是從原油樣本直接提取得到的,所以16SrDNA擴(kuò)增不能準(zhǔn)確反映出石油中的微生物群落的特點。Tanaka等報道,硫酸鹽還原菌的16SrDNA可以從原油樣本中直接擴(kuò)增。本文對中國長慶陜北油田石油集輸系統(tǒng)中原油樣本和采油污水樣本中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分析,所得結(jié)果對我們進(jìn)一步了解并控制石油污染源以及管線微生物腐蝕等具有重要的價值。1材料和方法1.1樣品的采集和處理樣本及取樣點分別從油井井口、石油計量站和石油綜合處理站同時采集原油和水樣。這些采樣點屬于中國長慶油田(陜北)的同一石油集輸系統(tǒng)。從油井到石油計量站的距離為13.2km,從石油計量站到石油綜合處理站的距離為25.6km。從油井中取油水混合樣品,將其靜置30min,取上層作為原油樣本,下層作為水樣。從石油計量站的油水重力分離器中收集原油樣本和水樣。石油綜合處理站的原油樣本和水樣分別取自儲油罐和污水罐。將這些樣本在4℃其下存儲以供分析之用。1.2方法1.2.1樣品的提取和濃縮根據(jù)Nobuyuki等人的方法,用2,2,4-三甲基戊烷(異辛烷)(中國上?；瘜W(xué)試劑廠)來處理原油樣本。將200mL原油加入到同等體積的異辛烷中,振蕩混勻,并在4℃下8000r/min離心20min。在離心后的沉淀物中加入等量的異辛烷,依照上述方法再進(jìn)行混合,離心。沉淀物懸浮在約10mL的異辛烷中,這些懸浮液可直接用來提取DNA。用土壤DNA快速提取試劑盒(Bio101;Carlsbad,CA,USA),按照說明來提取DNA。把樣品適當(dāng)稀釋,將試劑盒中提供的MT緩沖溶液加入同等體積到200μL的稀釋液中。用玻璃珠攪拌器(Mini-BeadBeater;BiospecProducts,Bartlesville,OK,USA),在3800r/min的速度下攪拌30s。進(jìn)行6次同樣的DNA提取操作后,獲得50μL的DNA溶液。用0.8μm的微孔過濾器(AdvantecToyoKaisha,Tokyo)過濾200mL的油田產(chǎn)水,再用0.45μm的微孔過濾器(AdvantecToyo)將濾液濃縮至約1mL。取450μL的濃縮菌液來提取細(xì)菌DNA。1.2.2pcr擴(kuò)增和轉(zhuǎn)染采用以下引物對真細(xì)菌16SrDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增:341F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′位于大腸埃希氏菌16SrDNA341～357bp)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′位于大腸桿菌16SrDNA907～926bp)。按照Muyzer等所述的方法將1個40bpGC發(fā)卡結(jié)構(gòu)(5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3′)連接到引物341F的5′端。PCR反應(yīng)混合物組成:上下游引物各25μmol/L,0.2mmol/LdNTP,2.0mmol/LMgCl2,2.5U的ExTaqDNA聚合酶(日本TaKaRa公司產(chǎn)品),以各不同濃度的DNA提取液作為模板。PCR反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性3min,共35個循環(huán)(每個循環(huán)包括:95℃1min,56℃1min;72℃1min),最后在72℃下延伸10min。PCR產(chǎn)物用作變性梯度凝膠電泳。用帶有GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物ARC344F(5P-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3P)和ARC915R(5P-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3P)分析古細(xì)菌。PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物(共100mL)包括:5～100ng的DNA模板,1×EXTaq緩沖溶液(TakaraShuzo,Kyoto,Japan),dNTP250μmol/L,各引物25pmol,2.5U的EXTaqDNA聚合酶(TaKaRa公司生產(chǎn)),用2滴礦物油(Sigma)覆蓋。PCR反應(yīng)條件如下:在94℃下預(yù)變性5min,進(jìn)行30個循環(huán)(每個循環(huán)包括:94℃變性1min,40℃1min;72℃1min),最后在72℃下延伸10min。1.2.3凝膠法pcrDGGE是按Muyzer等所述方法進(jìn)行,采用D-gene和D-code系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA),凝膠厚度為1.5mm。PCR產(chǎn)物直接上樣到變性梯度為20%～60%的0.06g/mL的聚丙烯酰胺凝膠中(100%的變性劑是由7mol/L尿素和0.45g/mL的甲酰胺組成的)。切下DGGE條帶,用帶有GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物341F與907R或帶有GC發(fā)卡結(jié)構(gòu)的ARC344F與ARC915R進(jìn)行PCR再擴(kuò)增。PCR二次擴(kuò)增產(chǎn)物再次在變性凝膠中進(jìn)行電泳以檢驗DGGE條帶的純度。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用CONCERT快速PCR純化試劑盒(Invitrogen,Carls-1bad,CA,USA)純化后,送請上海生物工程公司測序。1.2.4系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建所有的16SrDNA片段的序列通過BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜尋相似序列,將相關(guān)序列用DNA-MAN(version4.0)進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。本文中所報道的核苷酸序列數(shù)據(jù)已登陸NCBI/GenBank,序列接受號為EU912580到EU912600。2結(jié)果與分析2.1不同水樣點樣的樣點樣點樣點cl-、mg2+、ca2+、na+和hco3-的濃度變化表1所示為石油集輸系統(tǒng)中不同采樣點處的物理、化學(xué)特性。從氧化還原電位可以看出,石油集輸系統(tǒng)是一個厭氧環(huán)境。數(shù)據(jù)還顯示,油井取樣點水樣中Cl-、Mg2+、Ca2+、Na+和HCO3-的濃度幾乎和石油計量站和石油綜合處理站的取樣點相同。但是,從油井取樣點到石油綜合處理站取樣點SO42-的濃度逐漸降低,而SO32-、S2O32-的濃度逐漸增加。這表明,由于石油集輸系統(tǒng)是厭氧條件而且距離很長(約40km),因此在石油集輸過程中發(fā)生硫酸鹽還原為亞硫酸鹽的反應(yīng)。2.2細(xì)菌群落演替圖1所示為石油集輸系統(tǒng)水樣中存在菌群的DGGE圖譜,DGGE凝膠中顯示較為明顯的條帶均被切下并測序,相關(guān)的各種微生物種屬在表2中列出。來自3個不同取樣位點水樣的DGGE圖譜顯示,以下9個細(xì)菌種屬相關(guān)的基因序列檢出頻率較高:Ochrobactrumanthropi、Stenotrophomonasmaltophilia、Acidovoraxsp.、Arcobactersp.、Pseudomonassp.、Thiomicrospirasp.、Brevibacteriumsp.、Tissierellasp.和Peptostreptococcussp.,說明這些細(xì)菌是油田產(chǎn)水中的典型菌群,不是由于石油集輸系統(tǒng)污染造成的結(jié)果。而且,與Hippeamaritime相關(guān)的硫酸鹽還原菌在3個水樣中都被檢出,這可能是導(dǎo)致水樣中硫化物濃度較高的原因(表1)。硫酸鹽還原菌(SRB)產(chǎn)生的硫化物會導(dǎo)致長距離石油集輸系統(tǒng)管道的腐蝕,所以進(jìn)一步研究硫酸鹽還原菌非常重要。在油井井口、計量站、石油綜合處理站所取的水樣中菌群種類很相近,但是也存在著一定的群落演替,如圖2所示。其中β-變形菌綱微生物相關(guān)序列在油井井口、計量站、石油綜合處理站水樣中所占的比例分別為27%,30%和25%;高-G+C革蘭陽性菌相關(guān)序列在3處水樣中所占的比例分別為9%、10%和8%;α-變形菌綱細(xì)菌在3處水樣中所占的比例分別為18%、20%和17%。石油集輸過程中水相中的微生物群落的相似性為83.3%,這說明在石油集輸過程中微生物群落的結(jié)構(gòu)是較為穩(wěn)定的。不同取樣點水樣中也存在一些各自特有的細(xì)菌種屬,與Methylobacteriumrhodium相關(guān)的微生物基因序列在油井井口水樣中被檢出,Methylobacteriumspp.是兼性甲基營養(yǎng)菌。而且,一些Methylobacteriumspp.能夠氧化含2個或4個碳原子的烯烴,生成相應(yīng)的1,2-環(huán)氧化物。Bacillus和Staphylococcus只在石油綜合處理站的水樣中檢出。這些微生物種屬分布的差異表明在石油集輸過程中,水體中微生物生存環(huán)境發(fā)生了變化。2.3種特殊病毒群對石油集輸系統(tǒng)3個不同取樣點處原油樣品中微生物菌群的變化情況進(jìn)行了分析。DGGE圖譜顯示:原油中的各類菌群數(shù)量遠(yuǎn)低于同一位置的水樣(如圖1所示)。在石油集輸過程中,原油中的菌群的相似性為88.2%,表明原油中的菌群結(jié)構(gòu)比水中更為穩(wěn)定(水樣中的為81.3%)。原油中的特異性細(xì)菌,比如Burkholderiasp.、Brevundimonassp.和Propionibacteriumsp.只在油樣中被檢出;Ochrobactrumsp.和Stenotrophomonassp.在油樣和水樣中均被檢出。這說明以上5種菌(Burkholderiasp.、Brevundimonassp.、Propionibacteriumsp.、Ochrobactrumsp.和Stenotrophomonassp.)是原油中的優(yōu)勢菌群(表2)。而且Ochrobactrumsp.和Stenotrophomonassp.原本只存在與原油中,在從油井井口到石油綜合處理站這一集輸過程中,它們從原油中擴(kuò)散到水中。日本學(xué)者Watanabe等用分子生物學(xué)方法分析了油田地下水和原油儲存罐中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),但他們得出的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與本研究結(jié)果有很大差別,說明不同地區(qū)、不同地質(zhì)地層所產(chǎn)石油中,微生物群落結(jié)構(gòu)有所差別。2.4產(chǎn)甲烷菌群落用古細(xì)菌特異性引物嘗試從采自石油集輸系統(tǒng)中的原油樣本和水樣中研究古細(xì)菌的存在情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在原油樣本中沒有檢測到與古細(xì)菌相關(guān)的16SrDNA。然而,在計量站油水重力分離器和石油綜合處理站廢水罐的水樣中發(fā)現(xiàn)了一些產(chǎn)甲烷菌,序列聚類分析結(jié)果如圖3所示?？寺Y14與Methanocalculussp.相關(guān),與Methanomicrobials聚于同一菌簇中,該類細(xì)菌能夠利用H2和CO2進(jìn)行生長繁殖?？寺Y15,QY16和QY17分別與Methanogenicarchaeon,Methanosarcinasp.和Methanosaetasp.相關(guān),與Methanosarcinales聚于同一菌簇中,該類細(xì)菌利用乙酸而不用H2或CO2生長?？寺Y21不屬于已知的產(chǎn)甲烷菌簇,但是序列同源性分析顯示它是一種嗜熱菌(數(shù)據(jù)未給出)。Watanabe,etal.用16SrRNA基因克隆方法研究發(fā)現(xiàn)油田地下水中含有大量產(chǎn)甲烷菌,而且他們還估計,在油田地下水中甲烷生成的速率很高。一般情況下,產(chǎn)甲烷菌出現(xiàn)在包括產(chǎn)氫菌和硫酸還原菌在內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌群中,有文章稱產(chǎn)甲烷菌只在石油污泥的樣本中被檢出過。在我們的研究中也發(fā)現(xiàn),產(chǎn)甲烷菌存在于計量站油水重力分離器和石油綜合處理站廢水罐水樣中,可能是一些產(chǎn)甲烷菌從罐底污泥擴(kuò)散進(jìn)了水中,所以產(chǎn)甲烷菌在水樣中被檢出。本研究從原油樣本和水樣中直接提取出