2型糖尿病小鼠免疫適應(yīng)及腎臟病理改變的研究

2型糖尿病小鼠免疫適應(yīng)及腎臟病理改變的研究

2型糖尿?。╰2sd）是一種非胰島素依賴的糖尿病，占糖尿病患者的90%以上。近30年來(lái),我國(guó)T2DM患病率顯著增加,成為嚴(yán)重威脅人類身體健康的主要疾病之一。高脂飲食和肥胖是引起T2DM的主要致病因素。建立較為理想的符合人類T2DM發(fā)病過(guò)程和代謝特征的動(dòng)物模型,對(duì)探討糖尿病發(fā)病機(jī)制和評(píng)價(jià)降糖藥物療效有著非常重要的意義。目前,常用的T2DM動(dòng)物模型主要有兩類:(1)基因突變,基因敲除或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型,如ob/ob小鼠、db/db小鼠等。這類動(dòng)物模型由單基因異常引發(fā)疾病,遺傳因素占主導(dǎo)作用。其優(yōu)點(diǎn)是發(fā)病進(jìn)程穩(wěn)定,缺點(diǎn)是與絕大多數(shù)人類T2DM的致病機(jī)制不一致;(2)STZ腹腔注射誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型。STZ對(duì)胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用,能誘導(dǎo)產(chǎn)生糖尿病。國(guó)內(nèi)外普遍選用雄性大鼠來(lái)制備糖尿病模型。大劑量STZ會(huì)嚴(yán)重破壞胰島β細(xì)胞,導(dǎo)致胰島素分泌嚴(yán)重不足,這樣獲得的疾病模型更接近于1型糖尿病。先給予高脂高糖飲食,模擬人類T2DM的發(fā)病過(guò)程,再注射小劑量STZ誘導(dǎo),是建立T2DM動(dòng)物模型的有效方法。國(guó)內(nèi)外在制備大鼠T2DM模型方面研究較為深入,以小鼠為研究對(duì)象的造模研究較少。本文采用高脂高糖飲食再加上多次小劑量腹腔注射STZ的方法制備T2DM模型小鼠,分析了其生化變化和胰島,肝等組織病理形態(tài)變化,旨在了解此小鼠模型是否與人類T2DM的發(fā)病過(guò)程及病理形態(tài)改變一致。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)雄性C57BL/6J,5~6周齡,購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心:scxk粵2011-0015。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物房,室溫保持在25±2℃,濕度保持在(55±5)%。動(dòng)物自由進(jìn)食,自由飲水,每天保持12h的晝夜循環(huán)。開始實(shí)驗(yàn)前,動(dòng)物正常飲食飲水,適應(yīng)環(huán)境1周。所有實(shí)驗(yàn)操作符合科技部與南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求。1.2血糖儀和生化儀器STZ(貨號(hào)S0130),檸檬酸與檸檬酸鈉購(gòu)自Sigma。高脂高糖飼料(NO.0105825)由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物飼料組提供(合格證:SCXK(粵)2008-20002)。羅氏卓越型血糖儀與其試紙購(gòu)自Roche。胰島素抗體購(gòu)自Bioworld。二抗及顯色劑二甲基聯(lián)苯胺(DAB)購(gòu)自北京中杉金橋。生化儀(型號(hào)AU5431),Olympus。檸檬酸緩沖液,檸檬酸:稱取2.1g加入雙蒸水100ml中配成A液,檸檬酸鈉:稱取2.94g加入雙蒸水100ml中配成B液。A液與B液以1∶1的混合,過(guò)濾,pH計(jì)測(cè)定pH值,調(diào)節(jié)pH=4.2~4.5。1.32高脂高糖飼料的注射將36只小鼠隨機(jī)分成3組為:正常組(NC組),高脂飼料組(HC組),高脂飼料加STZ組(HC+STZ),每組各12只。NC組以普通飼料飼養(yǎng),HC組和HC+STZ組分別以高脂高糖飼料飼養(yǎng)。1個(gè)月之后禁食過(guò)夜。HC+STZ組以40mg/kg體質(zhì)量的劑量腹腔注射STZ(100mg/ml溶于檸檬酸緩沖液),24h后再注射等劑量STZ一次。NC組與HC組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液作為對(duì)照。STZ注射后HC組和HC+STZ組小鼠繼續(xù)高脂高糖飼養(yǎng)。每周采取禁食12h鼠尾血測(cè)定空腹血糖?？崭寡侵?gt;13.89mmol/L判定為造模成功小鼠。1.4血糖、胰島素抵抗STZ注射1個(gè)月之后進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食12h,以2g/kg體質(zhì)量的葡萄糖劑量灌胃。分別在0、0.5、1、1.5、2h采血測(cè)定血糖(BG)。用曲線下面積(AUC)來(lái)反映糖耐量和胰島素抵抗。AUG采用簡(jiǎn)化公式計(jì)算:AUG=1/4(BG0h)+1/2(BG0.5h)+3/4(BG1h)+1/2(BG2h)的。1.5血漿樣品的制備實(shí)驗(yàn)小鼠在注射STZ1月后,處理前禁食12h,摘眼球取血,2000r/min低溫離心10min,取血漿保存于4℃冰箱。ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、尿素氮(BUN)、甘油三脂(TG)、肌酐(CR)、總膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)等生化指標(biāo)采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(南方醫(yī)院檢驗(yàn)科)進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)樣品用雙蒸水稀釋3倍后上機(jī)測(cè)定。1.6小鼠輸注后肝臟功能損害模型胰腺組織的免疫組化分析:胰腺用4%多聚甲醛溶液固定24h,常規(guī)石蠟包埋,10μm切片,兔抗小鼠胰島素抗體孵育,常規(guī)DAB顯色,蘇木素復(fù)染。肝臟,腎臟組織病理學(xué)檢測(cè):肝臟組織用4%多聚甲醛溶液固定24h,常規(guī)石蠟包埋,10μm切片,蘇木素-伊紅染色。常規(guī)光學(xué)顯微鏡觀察。分析高脂飲食加STZ處理小鼠胰島β細(xì)胞的分布及肝臟的病理形態(tài)情況。1.7數(shù)據(jù)處理及分析方法實(shí)驗(yàn)各組所有數(shù)據(jù)都是用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多樣本之間采用單方向ANOVA進(jìn)行比較,并用Excel制作相應(yīng)的圖表。P<0.05判為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1平均血糖含量實(shí)驗(yàn)小鼠注射STZ后,每周測(cè)定小鼠的空腹血糖,連續(xù)檢測(cè)4周,結(jié)果如圖1。HC組小鼠1~4周空腹血糖都較NC組略有增加,但還在空腹血糖正常值(6.8mmol/L)范圍內(nèi)。HC+STZ組注射STZ1周后,平均血糖值為14.20±2.46mmol/L,有75%(9/12)的小鼠空腹血糖值大于13.89mmol/L。繼續(xù)給予高脂高糖飲食,到第2周再測(cè)空腹血糖,除1只小鼠死亡外,其余11只小鼠的空腹血糖值均超過(guò)13.89mmol/L,平均血糖值為15.12±1.39mmol/L,造模成功率為91.7%(11/12)。第3周平均空腹血糖值較第2周略有下降,血糖值為14.45±1.33mmol/L。第4周平均血糖值又有較大升高,為17.88±3.11mmol/L。整個(gè)造模過(guò)程,12只小鼠只有1只死亡,死亡率為8.3%(1/12)。2.2小鼠體質(zhì)量的變化各組實(shí)驗(yàn)小鼠在注射STZ前后的體質(zhì)量變化情況見表1。與NC組相比,經(jīng)過(guò)高脂高糖飼養(yǎng)1月后,HC組和HC+STZ組小鼠體質(zhì)量都比NC組顯著增高(P<0.01)。HC+STZ組在腹腔注射STZ兩周后,小鼠的活動(dòng)度減小;注射STZ1月后,HC+STZ組小鼠毛發(fā)蓬松,缺乏光澤,活動(dòng)度顯著下降。在注射STZ1月之后,HC組和HC+STZ組體質(zhì)量增加不明顯,但與NC組相比,體質(zhì)量依然有顯著性差異(P<0.01);HC+STZ組體質(zhì)量與HC組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。2.3小鼠血糖、胰島素抵抗的變化小鼠在注射STZ1月后的OGTT試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。HC+STZ組在口服葡萄糖后0、1、1.5、2h的血糖值均顯著高于NC組和HC組(P<0.01);HC組口服葡萄糖后,1、1.5、2h的血糖值均高于NC組,但其中只有1.5h血糖值有顯著差異(P<0.05),其他時(shí)間點(diǎn)血糖值的增高均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2A)。計(jì)算NC組的AUC為20.97±3.38;HC組的AUC為27.41±1.73;HC+STZ組的AUC為45.47±0.98。HC組AUG比NC組略有升高(P<0.05),HC+STZ組AUC則比NC組或HC組顯著增高(P<0.01,圖2B)。說(shuō)明HC+STZ組小鼠的糖耐量顯著下降,表現(xiàn)為明顯的胰島素抵抗現(xiàn)象。HC組糖耐量略有下降,有輕度的胰島素抵抗。2.4對(duì)臟器濾過(guò)功能的影響實(shí)驗(yàn)小鼠血漿的生化檢測(cè)結(jié)果見表2。HC+STZ組CR,BUN、ALT等含量與HC組相比都有不同程度的增高趨勢(shì),其中HC+STZ組CR較NC組顯著增高(P<0.01),也較HC組顯著升高(P<0.05)。HC+STZ組和HC組TG和CHOL的含量比NC組略有增高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。CR和BUN是反映腎臟濾過(guò)功能的指標(biāo),而ALT與TG和CHOL分別是反映肝臟損傷和脂質(zhì)代謝的指標(biāo)。上述結(jié)果表明高脂高糖飲食使小鼠血脂增高,STZ腹腔注射誘發(fā)糖尿病后,引起了腎功能和肝功能的病理改變。2.5小鼠胰島結(jié)構(gòu)的變化,依據(jù)dab顯色區(qū)域差異胰島β細(xì)胞免疫組化檢測(cè)結(jié)果見圖2。用抗胰島素抗體檢測(cè)胰腺組織中β細(xì)胞的分布和胰島素的分泌水平。圖2中團(tuán)塊狀的大小和形態(tài)不一的黃褐色DAB顯色區(qū)域即是胰島結(jié)構(gòu),細(xì)胞核顯藍(lán)色,DAB顯色的深淺反映胰島素的分泌水平。NC組DAB顯色較深,胰島結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞排列規(guī)整。HC組DAB顯色較NC組稍淺,胰島的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。HC+STZ組DAB顯色較淺,胰島內(nèi)有一個(gè)或多個(gè)空泡,β細(xì)胞排列不規(guī)則,有明顯萎縮跡象。2.6小鼠肝組織結(jié)構(gòu)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟組織切片HE染色觀察顯示(圖3,4)。HC+STZ組和HC組小鼠部分肝組織結(jié)構(gòu)中可見空泡樣細(xì)胞,有輕度脂肪肝樣變。3組小鼠腎臟組織未發(fā)現(xiàn)明顯的病理病理改變。3小鼠的血糖和胰島素功能變化高脂飲食和肥胖是引起T2DM的主要誘因。約有60%~80%的成年糖尿病患者在發(fā)病前均為肥胖者,肥胖的程度與T2DM的發(fā)病率呈正比。最新研究顯示,高脂飲食和肥胖與炎癥及T2DM的發(fā)生密切相關(guān)。脂肪酸是前列腺素E2、白三烯和血栓環(huán)素等炎癥介質(zhì)生物合成的原料。肥胖患者和高脂飲食所致的脂肪堆積會(huì)引起體內(nèi)長(zhǎng)期慢性的炎癥反應(yīng),使胰島功能受損,并產(chǎn)生胰島素抵抗。正是由于生活水平的提高,我國(guó)近三十年來(lái)T2DM的患病率增高了近十倍。以往,糖尿病動(dòng)物模型的建立多采用大劑量STZ注射方法。大劑量STZ注射會(huì)造成胰島β細(xì)胞的大量破壞,制備出的是1型糖尿病動(dòng)物模型,并且容易引起受試動(dòng)物大量死亡。低劑量STZ處理,受損的胰島細(xì)胞又常能自我修復(fù),造模成功率較低。本文我們采用高脂飲食結(jié)合低劑量STZ多次腹腔注射方法制備T2DM小鼠模型。受試小鼠先接受高脂高糖飲食,產(chǎn)生一定程度的胰島素抵抗,再用小劑量STZ破壞部分胰島β細(xì)胞,造成胰島素分泌不足。這樣既不會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞的大量破壞,又可使β細(xì)胞不容易自我修復(fù),能更好地誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠往T2DM發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)小鼠給予高脂高糖飲食1個(gè)月,小鼠體質(zhì)量顯著增加。注射STZ1周后,有75%(9/12)的小鼠空腹血糖值大于閾值13.89mmol/L。到第2周除1只小鼠死亡外,其余小鼠的空腹血糖值均超過(guò)閾值,造模成功率為91.7%(11/12)。注射STZ1個(gè)月后的OGTT試驗(yàn)顯示,HC+STZ組在口服葡萄糖后1~2h的血糖值均顯著升高,AUC顯著高于HC組和NC組。說(shuō)明HC+STZ組小鼠口服糖耐量顯著下降,表現(xiàn)為明顯的胰島素抵抗現(xiàn)象。單純接受高脂高糖飲食的HC組小鼠空腹血糖仍在正常值范圍內(nèi),但糖耐量有一定程度下降,并出現(xiàn)輕度胰島素抵抗。提示,單純高脂高糖飲食很難誘發(fā)C57BL/6J小鼠發(fā)生典型的T2DM病變。只有在給予長(zhǎng)期的高脂高糖飲食的同時(shí),注射STZ選擇性破壞部分胰島β細(xì)胞,降低胰島素的分泌,才能引起糖耐量下降和胰島素抵抗等典型的T2DM病理表現(xiàn)。生化檢測(cè)結(jié)果顯示,高脂飲食的HC+STZ組和HC組小鼠TG、CHOL的含量有增高的趨勢(shì),HC+STZ組小鼠ALT升高明顯。病理檢查顯示,HC+STZ組和HC小鼠肝組織見空泡樣結(jié)構(gòu)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與成細(xì)華等報(bào)道的,給予胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂的MKR小鼠高脂飲食所導(dǎo)致的ALT升高和血脂(CHOL、LDL)升高等肝功能損傷指標(biāo)和脂肪代謝異?；疽恢隆Ｕf(shuō)明高脂高糖飲食會(huì)引起小鼠脂肪肝病變,高血脂、高血糖也會(huì)損傷肝臟,導(dǎo)致ALT升高。生化檢測(cè)結(jié)果還顯示,HC+STZ組小鼠血漿CR含量顯著增高,BUN也有增高趨勢(shì),提示有腎小球?yàn)V過(guò)障礙。長(zhǎng)期的高血糖能夠引起滲透性利尿,加速腎臟的損傷,影響腎臟的濾過(guò)功能。說(shuō)明高脂高糖飲食結(jié)合STZ注射所致的T2DM小鼠已有一定程度的腎功能障礙。但腎臟的病理檢查尚未發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)改變。STZ注射后,第1周小鼠空腹血糖值已有明顯升高,第2周進(jìn)一步升高,第3周略為降低,第4周又大幅升高。此時(shí),小鼠毛發(fā)蓬松,色澤灰暗,活動(dòng)度顯著減小。免疫組化結(jié)果顯示,高脂飲食的HC組小鼠胰島β細(xì)胞胰島素的分泌量減弱,HC+STZ組表現(xiàn)為胰島細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)大量β細(xì)胞萎縮、空泡化和纖維化的現(xiàn)象。提示高脂高糖飲食會(huì)引起胰島素分泌減少,減弱胰島功能。STZ對(duì)胰島β細(xì)胞有明顯的破壞作用。STZ注射后2周內(nèi)胰島細(xì)胞受損明顯,第3周胰島β細(xì)胞有部分修復(fù),但第4周高血脂、高血糖又進(jìn)一步損傷胰島功能。高脂飲食結(jié)合STZ注射所致的T2DM小鼠模型,模擬了人類高脂飲食和肥胖的發(fā)病過(guò)程,其血糖的動(dòng)態(tài)變化及病理改變等方面與人類的2型糖尿病的發(fā)病情況非常接近,比基因突變T2DM小鼠模型,如db/db小鼠和新西蘭肥胖小鼠(NZO)等,更適合用于評(píng)價(jià)降糖藥物的療效?；蛲蛔僒2DM小鼠模型,遺傳因素起主導(dǎo)作用,與絕大多數(shù)人類T2DM的致病機(jī)制