穴位電刺激對廢用性肌萎縮肌細胞凋亡的影響

穴位電刺激對廢用性肌萎縮肌細胞凋亡的影響

在廢棄的狀態(tài)下，骨瘦如長期躺下的患者，四肢骨瘦如長期使用的患者會顯著減少。老年人也由于活動的減少,四肢骨骼肌發(fā)生明顯的萎縮。細胞凋亡可能在老齡化功能喪失過程中起到很重要的作用。細胞凋亡是一種不同于病理性壞死的細胞死亡方式,它是指在活組織中細胞受信號傳導(dǎo)的調(diào)控,通過主動過程而死亡的現(xiàn)象,是維持細胞增殖與死亡間平衡的重要方式。因此,如何有效地預(yù)防和治療廢用性骨骼肌萎縮的研究,目前已成為運動醫(yī)學(xué)研究的熱點。本研究采用穴位電刺激的方法,觀察其對廢用性肌萎縮肌細胞凋亡的干預(yù)作用。1實驗材料1.1動物和藥物的實驗SD雄性大鼠18只,清潔級,體質(zhì)量170~230g,12h/12h的晝夜光照,自由進食和飲水。戊巴比妥鈉由廣州化學(xué)試劑廠進口分裝。1.2精密儀表檢測YXQ-LS-30SII全自動高壓蒸汽滅菌器(上海精密儀器儀表有限公司);B3雙目攝影生物顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團公司出產(chǎn));CM1900型冰凍切片機(Leica);UltraVIEWERS共聚焦顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(PerkinElmer);GZX-DH202-4-S型恒溫干燥箱(上海精密儀器儀表有限公司);電針用6805-A型電針治療儀(廣東汕頭醫(yī)療器械廠制造)。2實驗方法2.1不同懸吊方式大鼠的對接模型組和電刺激組復(fù)制肌肉萎縮模型,模型采用Morey-Holton和Globus的懸吊方法,先將大鼠的尾部用75%的醫(yī)用酒精消毒,在尾部近段2/3的兩側(cè)貼敷醫(yī)用膠布,膠布的末端固定于懸吊籠的金屬吊環(huán),調(diào)整大鼠身體長軸與懸吊籠水平底部保持30°夾角,金屬吊環(huán)可以旋轉(zhuǎn),保證大鼠在籠內(nèi)可以自由活動,懸吊3周。2.2穴位電刺激試驗先按體重分層,再按隨機數(shù)字表法隨機分為3組:對照組、模型組和電刺激組。其中電刺激組于造模完成后,采用華興邦動物穴位圖譜并結(jié)合模擬人體經(jīng)穴法取足三里穴位,進行穴位電刺激。電針用6805-A型電針治療儀,電針參數(shù)選擇頻率范圍2~15Hz,空載電壓20~35V,強度以下肢輕微顫抖為宜,調(diào)制脈沖為疏密波,時間30min,1次/天,整個實驗周期3周。對照組、模型組不予電刺激。2.3鞋肌的固定、冷凍懸吊3周后,將大鼠處死。迅速分離脛骨前肌,稱重,將脛骨前肌在液氮中迅速固定,OCT包埋,然后置于-70℃恒溫冷凍冰箱。在冷凍切片機內(nèi),連續(xù)切片,將肌腹部連續(xù)的兩片用來做H&E染色。2.4凋亡核酸標(biāo)記每張切片取3個不同部位的切片各2張,以脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediatedfluorescein-dUTPnickendlabeling,TUNEL)標(biāo)記凋亡細胞核DNA3’OH端。主要步驟為:切片常規(guī)脫蠟入水,標(biāo)本片加TBS1∶200新鮮稀ProteinaseK37℃消化15min,0.3%H2O2甲醛滅活內(nèi)源性過氧化物酶(POD)活性,加入TUNEL混合液(含TdT酶及fluorescein-dUTP)37℃孵育1h,加入POD轉(zhuǎn)換液37℃孵育30min,DAB顯色,蘇木青輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。正常細胞核呈藍色,凋亡細胞核呈深淺不一的棕褐色。切片于光鏡下200倍放大,經(jīng)圖像分析儀隨機選擇10個視野,檢測陽性表達率(陽性核占視野中總細胞核百分比),作為細胞凋亡指數(shù)(apoptosisindex,AI)。2.5統(tǒng)計處理全部數(shù)據(jù)均用單因素方差分析,在SPSS13.0統(tǒng)計軟件包中進行處理,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準差(xˉ±sxˉ±s)表示。3結(jié)果3.1肌纖維橫截面積比較肌組織病理觀察:肌組織切片經(jīng)HE染色,鏡下觀察模型組可見肌纖維橫截面積明顯減小,電刺激組肌纖維橫截面積減小較模型組輕,對照組及電刺激組與模型組比較均存在顯著差異。3.2凋亡陽性細胞肌細胞凋亡圖像分析:對照組僅見極少量凋亡陽性細胞,模型組肌細胞凋亡明顯增多,電刺激組肌細胞凋亡均顯著減少,對照組及電刺激組與模型組比較均存在顯著差異。4氣調(diào)血,扶本培元針刺法穴位電刺激調(diào)控肢體功能的中醫(yī)理論基礎(chǔ)是“經(jīng)絡(luò)內(nèi)屬臟腑,外絡(luò)于肢節(jié)”,因此電刺激一定穴位可影響相應(yīng)的功能。十二經(jīng)脈中與肌肉、四肢密切相關(guān)的是足陽陰經(jīng),其中脾位于腹中,與胃黏膜相連。二者經(jīng)絡(luò)上互為絡(luò)屬,構(gòu)成表里;生理上互相聯(lián)系,互相依賴,互相協(xié)調(diào),分工合作,共同完成消化功能。病理上互相影響,互相傳變,所以說脾與胃的關(guān)系極為密切。人體肌肉之所以能強壯豐滿,四肢活動有力,主要是依靠飲食所化的精氣。精氣經(jīng)脾胃傳輸以達四肢百骸。故脾胃健運則機體肌肉豐滿,四肢活動有力。脾胃失運則四肢無力,肌肉消瘦、甚至萎軟不用。足三里穴被視為強壯穴,針灸可健脾和胃,扶正培元,通經(jīng)活絡(luò),升降氣機。現(xiàn)代研究亦證實益氣調(diào)血扶本培元針刺法能有效地增加Bcl-2表達,抑制Bax表達,從而減少大鼠細胞凋亡,并促進其存活;“益氣調(diào)血,扶本培元”針法能夠良性調(diào)節(jié)老化相關(guān)基因的表達,并可能通過該種作用延緩衰老;針刺在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均可上調(diào)CuZnSOD的表達水平,從而增強抗氧化酶活性,以有效地清除自由基。本實驗采用穴位電刺激治療廢用性肌肉萎縮,并觀察其對骨骼肌細胞調(diào)亡的影響,從而探討穴位電刺激治療廢用性肌肉萎縮的機制。用懸吊方法復(fù)制肌肉萎縮模型,雄性SD大鼠18只隨機分成對照組、模型組和電刺激組,每組6只。采用HE染色及DNA末端標(biāo)記法(TUNEL)分別觀察肌組織病理變化與肌細胞凋亡的變化。研究發(fā)現(xiàn)肌組織切片經(jīng)HE染色,模型組可見肌纖維的萎縮,肌細胞凋亡明顯增多;對照組肌組織無明顯變性,僅見極少量凋亡陽性細胞;電刺激