一種抗ha-cds脫菌-免疫吸附納米熒光碳點(diǎn)的制備及初步應(yīng)用

一種抗ha-cds脫菌-免疫吸附納米熒光碳點(diǎn)的制備及初步應(yīng)用

建立快速檢測方法，快速診斷食物源性疾病的致病性微生物，有助于制定快速處理措施。隨著材料科學(xué)的快速進(jìn)展,一類新型納米熒光標(biāo)記材料———納米熒光碳點(diǎn)(carbondots,CDs),因其獨(dú)特的光學(xué)特性,尤其有熒光穩(wěn)定、生物相容性好等特點(diǎn),已開始應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在對合成的CDs進(jìn)行前期生物相容性研究的基礎(chǔ)上,本研究以乙型副傷寒沙門菌為例,結(jié)合抗體耦聯(lián)磁珠粒的富集作用,初步探討建立應(yīng)用CDs技術(shù)快速檢測樣本中病原微生物的免疫學(xué)檢測方法。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)試劑和菌株1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)購自Sigma公司;BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)購自碧云天生物技術(shù)研究所;磁珠粒試劑盒購自上海奧潤微納公司。CDs自制,方法參見文獻(xiàn)?？股抽T菌O4因子抗體(抗O4)和抗Ha因子抗體(抗Ha)均購自寧波天潤公司。非特異性抗體正常兔IgG為本室自制。乙型副傷寒沙門菌株和大腸埃希菌均為江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心微生物室保存。免疫親和分離液用含8mol/L尿素、10g/LSDS、1g/LBSA、pH7.0的PBS。1.2leicacssp5CaryEclipse熒光光譜儀(美國Varian公司);LeicaTCSSP5激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司);Rainbow酶聯(lián)免疫分析儀(奧地利Tecan公司);磁分離器(美國Invitrogen公司)。1.3抗o4抗體耦合取磁珠粒(10mg/mL)200μL于1.5mL的Eppendorf管中,加入終濃度4g/L的抗O4抗體,在pH7.2條件下用碳二亞胺法將抗O4抗體耦聯(lián)到磁珠粒上,在磁分離器上將未結(jié)合的抗體洗去后,用PBST液(pH7.4,0.01mol/L,含10g/LBSA、0.05%吐溫和0.2g/LNaN3)重懸磁珠粒,即獲得抗體耦聯(lián)磁珠粒。1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備用pH7.4、0.2mol/L的PBS將0.5g/LBSA稀釋成0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L8個濃度,按1.3方法耦聯(lián)磁珠粒,用酶聯(lián)儀檢測吸光度(A),制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,以此標(biāo)準(zhǔn)曲線對實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記用的抗體進(jìn)行定量。磁珠粒耦聯(lián)抗體的效率按以下公式計算。耦聯(lián)效率=[(耦聯(lián)用抗體量-耦聯(lián)后上清液抗體量)/耦聯(lián)用抗體濃度]×100%。1.5抗o4-磁珠粒富集細(xì)菌的能力取1滴制備好的抗O4-磁珠粒加在載玻片上,加入適量乙型副傷寒沙門菌,混勻,待充分反應(yīng)后,洗去游離的細(xì)菌,將抗O4-磁珠粒晾干后,革蘭染色,借助激光共聚焦顯微鏡觀察抗O4-磁珠粒富集細(xì)菌的能力。用非特異性抗體耦聯(lián)的磁珠作對照。1.6sds的組成和性能1.7抗ha抗體制備用碳二亞胺法將抗Ha抗體耦聯(lián)到CDs上。具體方法如下:取1mg/mL羧基化的CDs溶液200μL,加入PBS(pH7.2,0.01mol/L)400μL,再加入EDC20mg,溶解,混勻,渦旋5min后,再室溫靜置15min。然后,加入NHS5mg,溶解,混勻,渦旋15min,再加入終濃度8g/L抗Ha抗體,混勻,室溫渦旋1h。將上述溶液12000r/min、4℃離心20min,移除上清液(上清液可以用于耦聯(lián)效率的計算),加入PBS100μL,洗滌2次,再加入PBS100μL,徹底混勻,即為抗Ha抗體耦聯(lián)CDs(抗Ha-CDs)。1.8抗cds耦合抗體的親和力檢測1.9顆粒凝集試驗(yàn)取1滴抗Ha-CDs加在載玻片上,與適量乙型副傷寒沙門菌混勻,靜置數(shù)分鐘后觀察結(jié)果。出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象為陽性反應(yīng)。用非特異性抗體耦聯(lián)的CDs作陰性對照。1.10菌液濃度pbs將乙型副傷寒沙門菌接種在普通營養(yǎng)肉湯中,37℃培養(yǎng)15~18h,然后用無菌PBS(0.01mol/L,pH7.2)作10倍系列稀釋,得到不同濃度的菌液。取該菌液涂布于普通瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)48h,計數(shù)生長菌落,得到菌液濃度(CFU/mL)。大腸埃希菌的菌液制備同此。1.11磁分離和測定cds取抗O4-磁珠粒480μL,加入到12mL含不同濃度細(xì)菌(101~107CFU/mL)的樣本液中,室溫渦旋混勻30min,將樣本置磁分離器上靜置5min,去除上清液,加入PBS(pH7.4,0.01mol/L)重復(fù)分離3次后,用PBS重懸磁珠。加入抗Ha-CDs480μL,室溫渦旋混勻30min,同上法再進(jìn)行磁分離,重復(fù)3次。加免疫親和分離液2.4mL重懸并解離CDs,磁分離器上分離磁珠粒后,用熒光光譜儀測定激發(fā)波長408nm時免疫親和分離液中CDs的熒光強(qiáng)度。用生理鹽水作空白對照,用大腸埃希菌作陰性對照。以空白對照管進(jìn)行儀器調(diào)零,檢測各管的熒光強(qiáng)度。2實(shí)驗(yàn)和結(jié)果2.1抗o4抗體濃度的確定將磁珠粒在不同pH值(6.0~8.0)條件下,與抗O4抗體耦聯(lián),確定最適耦聯(lián)pH為pH7.2。在pH7.2條件下,取磁珠粒與不同蛋白質(zhì)濃度(2、4、6、8、10g/L)的抗O4抗體耦聯(lián),確定最適耦聯(lián)抗體濃度為4g/L。在此基礎(chǔ)上,再觀察不同耦聯(lián)時間(30、60、90、120、150和180min)對耦聯(lián)效率的影響,確定最適耦聯(lián)時間為120min。根據(jù)方法1.4中公式,計算出抗O4抗體耦聯(lián)磁珠粒的效率為45.0%。2.2抗o4-磁珠粒與乙型副傷寒沙門菌的可能配合結(jié)果顯示:耦聯(lián)抗O4抗體的磁珠?？山Y(jié)合乙型副傷寒沙門菌(圖1B中紅色的是乙型副傷寒沙門菌),而非特異性抗體耦聯(lián)的磁珠粒不能結(jié)合該細(xì)菌(圖1A),表明抗O4-磁珠粒可特異性結(jié)合乙型副傷寒沙門菌。2.3抗ha抗體環(huán)境質(zhì)量的模擬本實(shí)驗(yàn)中所用CDs直徑3~5nm,較均勻、無團(tuán)聚現(xiàn)象,激發(fā)波長為408nm,發(fā)射波長為487nm,表面含羧基(-COOH)。參照2.1方法進(jìn)行耦聯(lián)條件的優(yōu)化,結(jié)果表明抗Ha抗體耦聯(lián)CDs的最適pH為7.2,最適抗體濃度為8g/L,最佳時間為1h。在此條件下,抗Ha抗體耦聯(lián)CDs的耦聯(lián)效率為38.0%。2.4壓縮波長的選擇抗Ha因子-CDs的熒光發(fā)光特性檢測結(jié)果顯示,CDs在耦聯(lián)抗體后。其發(fā)射波長由耦聯(lián)前的488nm變?yōu)轳盥?lián)后的490nm。玻片凝集反應(yīng)結(jié)果表明,抗Ha-CDs能與乙型副傷寒沙門菌發(fā)生凝集,而非特異性抗體耦聯(lián)的CDs與乙型副傷寒沙門菌不發(fā)生凝集。2.5菌液濃度對熒光強(qiáng)度的影響結(jié)果顯示,當(dāng)樣本中菌量達(dá)到103CFU/mL,隨著菌液濃度的增加,熒光強(qiáng)度也隨之增加。而大腸埃希菌對照則無此量變的效應(yīng),即CDs熒光信號無變化,見圖3。3cds的熒光檢測近年來,新型納米熒光材料不斷被開發(fā),并用于生物標(biāo)記。其中,量子點(diǎn)(quantumdots,QDs)因熒光穩(wěn)定性強(qiáng)、抗光漂白、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄等特點(diǎn),得到生物醫(yī)藥界較多關(guān)注,并用于生物活體標(biāo)記和檢測應(yīng)用中。但有研究發(fā)現(xiàn),目前研究最多的CdSeQDs和CdTeQDs因含重金屬離子,在生物體內(nèi)或標(biāo)記過程中呈現(xiàn)出一定的生物毒性。而本文利用的另一納米級熒光材料CDs有著與QDs類似的熒光特性,但合成方法更簡單。我們前期的研究結(jié)果顯示,CDs在體外對細(xì)菌的細(xì)胞毒性較弱。為此,本文利用CDs耦聯(lián)特異抗體建立了快速檢測樣本中乙型副傷寒沙門菌方法。結(jié)果顯示,其檢測靈敏度可達(dá)103CFU/mL,并可在2h內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)中CDs的熒光信號可用便攜式光譜儀進(jìn)行檢測,因而可滿足現(xiàn)場檢測的需要。另外,盡管本實(shí)驗(yàn)中檢測的是乙型副傷寒沙門菌,但若在體系中改變耦聯(lián)用特異性抗體,可使該方法適于檢測目前大多數(shù)病原