哺乳動物組織基因組DNA提取實驗報告

實驗序號實驗名稱哺乳動物組織基因組DNA提取實驗時間是否小組合作是（√）否（）一．實驗預(yù)習(xí)1．實驗?zāi)康模海?）掌握動物基因組DNA提取的原理和操作方法；（2）掌握相對分子質(zhì)量較大的DNA的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。2．實驗原理：1）本實驗利用去垢劑SDS(十二烷基磺酸鈉)是為了使蛋白變性并溶解細(xì)胞膜中的脂質(zhì)從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，而細(xì)胞裂解物又常用蛋白酶K和蛋白進(jìn)行水解處理。隨后用酚：氯仿進(jìn)行抽提，以去除殘留的蛋白質(zhì)，這時蛋白質(zhì)將進(jìn)入有機相，或者假如己變性的話將呈現(xiàn)在有機相與水相之間。氯仿處理是為了去除苯酚，而乙醇沉淀處理則可以濃縮DNA，同時去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。2）為了進(jìn)一步保護DNA樣品的完整性，通常需要在緩沖液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，這樣將會減少脫氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因為該酶必須在有Mg2+存在時才會起作用。3）本實驗方法分離得到的染色體DNA樣品易被限制酶切割，用此方法得到的DNA長度為100~150kbp，因此，較適用于適用于λ噬菌體基因組文庫和Southern雜交的研究。如果所制備的基因組DNA是用于構(gòu)建克隆文庫，要求得到較大分子量的DNA，則必須省略其中的振蕩步驟3．實驗器材與試劑：（1）實驗儀器（apparatus）：高壓滅菌鍋（Autoclave）、電子天平（Electronicbalance）玻璃勻漿器（Glasshomogenizer）、高速冷凍離心機（Highspeedrefrigeratedcentrifuge）、超低溫冰箱（Ultracoldstoragefreezer）、微波爐（microwaveoven）、微量加樣器（Pipettes）、電泳系統(tǒng)（ElectrophoresisSystem）、紫外透射儀（Ultraviolettransilluminator）、恒溫水浴鍋（constanttemperatureboiler）等；（2）實驗材料（Material）：小白鼠（Liverofmice）（3）實驗試劑（Reagents）：50ml生理鹽水（0.85％NaCl）、Aceticacid(醋酸)、dddH2O（三蒸水）、Phenol（苯酚）、Chloroform（氯仿）、Ethanol（乙醇）、Isoamylol（異戊醇）、TEbuffer（TE緩沖液）、Boricacid（硼酸）、Sugar（蔗糖）、Agarose（瓊脂糖）、Bromophenolblue（溴酚藍(lán)）、GelviewFluorescentdye（Gelview熒光染料）及NaOH等。注意：以上試劑均需高壓滅菌。此外的還需要的試劑及其配制方法如下所示：①5mol/L氯化鈉（NaCl）：溶解14.6g氯化鈉于足量的水中，定容至50ml；②0.5mol/L乙二胺四乙酸pH8.0（EDTA）:配制等摩爾的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三鈉鹽。或稱取9.31g的Na2EDTA·2H2O和1g的NaOH，pH調(diào)至8.0，并溶于約40ml水中，定容至50ml③3mol/L乙酸鈉pH5.2（Sodiumacetate）：溶解20.4g的三水乙酸鈉于約40ml水中，用冰乙酸調(diào)溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml；④2％十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱取1gSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含40ml的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至50ml；⑤40%氫氧化鈉（NaOH）：溶解40g氫氧化鈉顆粒于約90ml水的燒杯中（磁力攪拌器攪拌），氫氧化鈉完全溶解后用水定容至100ml。⑥1mol/L鹽酸（HCl）：加8.6ml的濃鹽酸至91.4ml的水中。⑦10mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：將100mg的蛋白酶k加入到9.5ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。⑧10mg/mlRnase（無DNase）（DNase－freeRNase）：即無DNA酶的核糖核酸酶溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中（pH5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris－HCl調(diào)pH至7.5，于-20℃貯存。（配制過程中要戴手套）；⑨1mol／LTris.HCl緩沖液（Tris-HClbufferpH8.0）：將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中，再根據(jù)所要求的pH（25℃下）加入46ml的濃鹽酸，用蒸餾水調(diào)整終體積至1L；⑩6×凝膠加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)（bromophenolblue）：取60ml雙蒸水，將250mg溴酚藍(lán)溶解于其中；40%(W／V)蔗糖水溶液（sucroseinwater）：在上述溶液中加入40g蔗糖。另外：Ⅰ.100mL5×TBEpH8.0（電泳緩沖液）的配制：稱取5.4gTris，2.75g硼酸加入2mL0.5mol／LEDTA(pH8.0)溶液中，再用蒸餾水補加到100mLⅡ.10ml組織勻漿液（裝入10ml離心管中）的配制：100mmol／LNaCl：0.2ml（5MNaCl）25mmol／LEDTA(pH8．0)：0.5ml（0.5MEDTApH8．0)l0mmol／LTris.HCIpH8．0)：0.1ml（1MLTris.HCIpH8．0)加三蒸水:9.2mlⅢ.1ml酶解液（裝入1.5ml離心管中）:200mmol／LNaCl：0.04ml（5MNaCl）50mmol／LEDTA(pH8．0)：0.1ml（0.5MEDTApH8．0)20mmol／LTris.HCl(pH8．0)：0.02ml（1MTris.HCIpH8．0)1％SDS：0.5ml（2％SDS）200μg／mL蛋白酶K：0.02ml（10mg／mL）加三蒸水:0.32mlⅣ.提取液1：平衡酚(pH8.0)：氯仿：異戊醇（25：24：1）即配即用,每管加500ul平衡酚(pH8.0)：250ul氯仿：240ul異戊醇：10ulⅤ.提取液2：氯仿：異戊醇（24：1）即配即用,每支試管加500ul氯仿：480ul異戊醇：20ulⅥ.TE緩沖液：5ml10mmol／LTris.HCl(pH8．0)：0.05ml（1MLTris.HCIpH8．0)1mmol／LEDTA(PH8．0)：0.01ml（0.5MEDTApH8．0)最后加三蒸水至4.94mL4．實驗方法步驟及注意事項1）實驗方法步驟：第一步操作：破碎、酶解細(xì)胞（過夜）(1)取0.2g鼠肝，用冰冷的生理鹽水洗3次，然后置于2.0mL勻漿液中，用玻璃勻漿器勻漿至無明顯組織塊存在(冰浴操作，切勿將細(xì)胞破碎，可鏡檢觀察)；(2)將組織細(xì)胞液移至1.5mL離心管中，5000r／min離心30—60s，(盡可能在低溫下操作)，棄上清，若沉淀中血細(xì)胞較多，可再加入5倍于細(xì)胞體積的勻漿液洗一次；(3)沉淀加400uL無菌水迅速吹散，再加400uL酶解液，翻轉(zhuǎn)混勻(動作一定要輕)55℃水浴處理12—18h；第二步操作：抽提DNA、乙醇沉淀純化DNA(4)取20uLRNase加入1.5ml離心管內(nèi)，使RNase至終濃度200μg／mL，37℃水浴1h；(5)將待抽提的樣品等量分裝在兩支離心管內(nèi)，各加入等體積①提取液酚／氯仿／異戊醇500ul（25：24：1現(xiàn)配先用），抽提(慢慢旋轉(zhuǎn)混勻，傾斜使兩相接觸面增大)一次。4℃10min靜置，然后10000r／min離心10min；(6)用擴口吸頭移出含DNA的水相.(注意勿吸出界面中蛋白沉淀,有時如果DNA含量過高，水相在下層，實驗時注意觀察)；(7)然后加等體積②提取液:氯仿／異戊醇500ul（24：1現(xiàn)配現(xiàn)用）抽提，4℃靜置10min，然后10000r／min離心10min(若界面或水相中蛋白含量多，可重復(fù)5，6，7操作)；(8)用擴口吸頭小心吸出上層含DNA的水相，加1／10體積的NaAc，小心混勻(要充分)；(9)再向每管中加入2倍體積的無水乙醇，-20℃1-2h；(10)12000r／min離心15min，棄上清；(11)75％冷乙醇洗滌一次，12000r／min離心15min；(12)室溫干燥(不要太干，否則DNA不易溶解)，加入50μLTE緩沖液。輕搖混勻，即可得到實驗動物基因組DNA。存放于4℃；第三步操作：瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA（AgaroseGelElectrophoresis）(13)制備瓊脂糖凝膠（Preparationofthegel）：瓊脂糖凝膠濃度為0.3％；(14)加入ＤＮＡ樣品（LoadingDNAsamples）：DNAsamples16μl+Loadingbuffer4μl(15)電泳（Gel）：電壓120V(16)電泳結(jié)果的拍照（Gelphotography）：通過紫外透射儀檢測凝膠，然后獲取圖片。并將產(chǎn)物條帶與已知分子量的標(biāo)淮條帶進(jìn)行比較，便可以對合適分子量大小的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。2）注意事項：（1）所有用品均需要高溫高壓，以滅活殘余的DNA酶；（2）所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制；（3）；用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性；（4）用上述方法提取的DNA純度可以滿足一般實驗（如Southern雜交、PCR等）目的，如要求更高，可參考有關(guān)資料進(jìn)行DNA純化；（5）進(jìn)行小鼠基因組DNA樣品室溫干燥時，不要太過于干燥，否則DNA不易溶解；（6）在用冰冷的生理鹽水洗鼠肝之前，先要將玻璃勻漿器置于冰塊中，待溫度下降到一定程度再將鼠肝放入玻璃勻漿器，冰浴操作，但切勿將細(xì)胞破碎，整個過程盡可能在低溫下操作；（7）用無菌水迅速吹散沉淀，加入酶解液后，翻轉(zhuǎn)混勻時動作一定要輕；（8）抽提時慢慢旋轉(zhuǎn)混勻，傾斜使兩相接觸面增大，離心后用擴口吸頭移出含DNA的水相時，注意勿吸出界面中蛋白沉淀,有時如果DNA含量過高，水相在下層，實驗時注意觀察二．實驗內(nèi)容實驗現(xiàn)象與結(jié)果：此次試驗本小組所得紫外透射儀檢測凝膠照片顯示的天道如圖所示：小白鼠基因組DNA的電泳條帶圖對實驗現(xiàn)象、實驗結(jié)果的分析及其結(jié)論：對實驗現(xiàn)象的分析及其結(jié)論：從上述所示的DNA電泳條帶圖可以看出：小鼠基因組DNA的電泳條帶都在同一條水平線上，但同時條帶也有些暗淡，形狀不佳。（2）對實驗結(jié)果的分析及其結(jié)論：①本次實驗抽提所得到的小白鼠肝臟細(xì)胞基因組DNA樣品不純，可能含有其他的一些雜質(zhì)；②本次所用的凝膠濃度為0.3％，濃度過低，也有可能是導(dǎo)致電泳條帶形狀不佳的原