脂類細胞化學(xué)-蘇丹Ⅲ染色法實驗報告

山東大學(xué)實驗報告2015年3月12日姓名班級13級生命基地班學(xué)號同組者：科目細胞生物學(xué)實驗實驗題目脂類細胞化學(xué)--蘇丹=3\*ROMAN染色法第III染液，防止影響實驗結(jié)果；7.在進行觀察之前，應(yīng)當(dāng)用吸水紙盡可能地吸取染液后再進行觀察，這樣只有脂肪細胞呈橘紅色，對比較明顯。

附：課外拓展知識石蠟切片制備石蠟切片的制作過程主要包括：取材固定脫水透明透蠟,封藏透明染色貼片切片包埋

1．取材

材料的好壞直接影響到切片的質(zhì)量,無論取哪一種動植物材料,以下幾點是必須注意的.

（1）植物材料選擇時須盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動物材料取用時常對動物施以麻醉,常用的麻醉劑有氯仿和乙醚,或?qū)游餁⑺篮笱杆偃〕鏊枰慕M織.

（2）取材必須新鮮,這一點對于從事細胞生物學(xué)研究尤為重要,應(yīng)該盡可能割取生活著的組織塊,并隨即投入固定液.

（3）切取材料時刀要銳利,避免因擠壓細胞使其受到損傷.

（4）切取的材料應(yīng)該小而薄,便于固定劑迅速滲入內(nèi)部.一般厚度不超過2mm,大小不超過5×5mm2.

2．固定

組織和細胞離開機體后,在一定時間內(nèi)仍然延續(xù)著生命活動,會引起病理變化直至歸于死亡.為了使標本能反映它生前的正常狀態(tài),必須盡早地用某些化學(xué)藥品迅速地殺死組織和細胞,阻抑上述變化,并將結(jié)構(gòu)成分轉(zhuǎn)化為不溶性物質(zhì),防止某些結(jié)構(gòu)的溶化和消失.這種處理就是固定.除了上述作用外,固定劑會使組織適當(dāng)硬化以便于隨后的處理,還會改變細胞內(nèi)部的折射系數(shù)并使某些部分易于染色.

固定劑的作用對象主要是蛋白質(zhì),至于其他成分如脂肪和糖,在一般制作時不加考慮,如要觀察這些物質(zhì),可用特殊的方法將其固定下來。固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。

簡單固定劑即單一的固定劑,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸.其中,苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白,又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質(zhì)都不凝固。

簡單固定劑的局限性較大,如將其適當(dāng)混合,制成復(fù)合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等.固定劑的種類甚多,我們必須依據(jù)各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。

固定時,須注意以下幾點：

（1）固定劑應(yīng)有足夠的量,一般為組織塊體積的10～15倍.

（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質(zhì),可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘,再移入水溶性的固定液.

（3）材料固定后如不立即下沉,可將其中氣泡抽出.

（4）固定時間依材料大小、固定劑種類而異,可從1小時到幾十小時,有時中間需要更新固定劑.某些固定劑對組織的硬化作用較強,作用時間應(yīng)嚴加控制,不能過長.

（5）一般固定劑都以新配制的為好,用過的不能再用.有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者,一定要在使用前才混合.

（6）固定完畢,根據(jù)所用固定劑的不同,用水或乙醇沖掉殘留的固定劑,以免固定劑形成沉淀,影響以后組織塊的染色.

3．脫水

.脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑,如乙醇、丙酮等,脫水后必須再經(jīng)過透明,才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑,如正丁醇,脫水后即可直接透蠟。

常用的脫水劑是乙醇,因為它價格便宜,易于得到。為了避免劇烈的擴散引起的組織的強烈收縮,脫水步驟應(yīng)從低到高以一定的濃度梯度來進行,一般組織從30％乙醇開始,經(jīng)過50％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對于一些柔軟的組織應(yīng)從15％開始.脫水時間依據(jù)組織的類型和大小而定，一般各級乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓，應(yīng)使材料停留在70％乙醇中,因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體,高濃度乙醇有脆化組織作用,放置時間不能過長,另外,脫水必須在有蓋瓶中進行,以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不徹底.需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中,如需長期保存,可加入等量的甘油.4．透明

組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經(jīng)過透明.透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合,它取代了脫水劑后,石蠟便能順利地滲入組織。

透明劑的種類很多,較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。

5．透蠟和包埋

包埋用的石蠟,熔點在50～60℃之間,應(yīng)根據(jù)材料本身的硬度、切片的厚薄和當(dāng)時的氣溫條件來選用.一般動物材料最常用的石蠟熔點為52～56℃,植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的,切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時選用52～54℃的石蠟可順利切片,冬季可用熔點46～48℃的石蠟,夏季可選56～58℃的.

透蠟須在恒溫箱中進行,恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點3度,使經(jīng)過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理.純石蠟應(yīng)處理2～3次,透蠟的時間依材料性質(zhì)而定,一般每次需15～30min。

包埋具體做法；先準備好紙盒，,將熔蠟倒入盒內(nèi),迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部,切面朝下,再輕輕提起紙盒,平放在冷水中,待表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⒓埡邪慈胨?使其迅速冷卻凝固,30min后取出。

包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度,保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體.石蠟的迅速冷卻也很重要,否則包埋塊中將會產(chǎn)生結(jié)晶.以后切片時引起碎裂。

6．切片

在包埋以后,就可進行切片.包埋好的石蠟塊裝上切片機進行切片前還須進行固著和整修.

切片方法：

切片前,將刀口置放大鏡下觀察,選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削.將所要切的包埋塊固定在標本臺上,使包埋塊外切面與標本夾截面平行,并讓包埋塊稍露出一截.將刀臺推至外緣后松開刀片夾的螺旋,上好刀片,使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角,包埋塊上下邊與刀口平行.在微動裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度,將刀臺移至近標本臺處,讓刀口與組織切面稍稍接觸,這時就可以開始切片了。具體操作：右手轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)輪,左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子,并托住切下的蠟帶,待蠟帶形成一定長度后,右手停止轉(zhuǎn)動,持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起,平放于襯有黑紙的紙盒內(nèi),注意切片速度不宜太快,搖動轉(zhuǎn)輪用力應(yīng)均勻,防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻,還應(yīng)注意轉(zhuǎn)動的方向,以防標本臺后移而切不到片子.切片完畢,應(yīng)及時用氯仿將切片機的有關(guān)部分擦凈。

7．貼片

切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進一步處理,但是切片常有細小的橫紋,必須經(jīng)展平后才能貼附,否則影響染色和觀察.貼片一般有撈片法和燙板法.

撈片法：首先將切片分割開,投入到48℃的溫水浴中,這時切片都浮在水面上,由于表面張力的作用使切片自然展平,然后用涂有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個打破入杯中,去除蛋黃留下蛋白,用筷子充分調(diào)打成雪花狀泡沫,然后用雙層紗布過濾至容器中,加入等量的甘油,混合,最后加入百分之一體積的麝香草酚（thymol）作防腐用,可保存幾個月到一年.）或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片,使切片貼附在載玻片的合適位置,于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥。

燙板法：是將涂有粘片劑的載玻片上涂上水,把已分割好的切片貼上去,再置載玻片于35℃恒定的燙板上讓切片攤干,并傾斜或用吸水紙吸去水分,最后將載玻片再度放燙板上晾干.

要注意,不管是使用撈片法還是燙板法,所用的載玻片必須潔凈,不能有油污（檢驗法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水,若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀,即表示載玻片不清潔,有殘留油脂等物在上面）；切片的光面應(yīng)朝下,否則染色過程中切片容易脫落。

8．染色

染色方法很多,但是染色劑往往是水溶液,因此切片必須經(jīng)過脫蠟而再度復(fù)水.這方法即為脫水、透明的逆過程。由于切片十分薄,處理的時間大大減少,一般每級停留約2～5min。

染色是一個復(fù)雜的過程,研究細胞器和細胞內(nèi)的重要組分都有很多現(xiàn)成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應(yīng),顯示RNA的Brachet反應(yīng),顯示多糖的PAS反應(yīng),顯示蛋白質(zhì)的Millon反應(yīng)和顯示某些酶的鈣—鈷法等,可以根據(jù)不同的要求來選用。

9．透明

染色后的切片須再次經(jīng)過脫水、透明.標本經(jīng)二甲苯透明后,折射率改變,透明度提高,使得染上色的部位更清晰地顯示出來。

10．封藏

封藏的目的是使制成的切片能夠永久保存,封藏劑必須能與透明劑互溶,對染色無影響,折射率近似玻璃和具有粘性的物質(zhì),常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。

封片方法：將載玻片從二甲苯中吸出后,吸去多余的二甲苯,在標本上的二甲苯尚未干透之前加一滴樹膠,仔細覆蓋上蓋玻片,避免產(chǎn)生氣泡,也不得拖動蓋玻片,以免將標本破壞.樹膠量視蓋玻片大小而定,勿使過多過少。貼上標簽,注明材料、染色法,待封藏劑凝固后便成為一張石蠟切片.糖類細胞化學(xué)PAS法顯示糖類原理：過碘酸能使細胞內(nèi)的多糖乙二醇基氧化成二醛，再與Schiff氏液的無色品紅結(jié)合，紅色，定位于胞漿上。結(jié)果：PAS陽性為紅色，細胞核藍色。三、核酸細胞化學(xué)Feulgen反應(yīng)法原理：標本經(jīng)稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，從而在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。Schiff試劑中的無色品紅可與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物分子,因醌基為發(fā)色團，故可呈現(xiàn)出紫紅色。DNA經(jīng)稀酸水解后產(chǎn)生的醛基，具有還原作用，可與無色品紅結(jié)合形成紫紅色化合物，從而顯示出DNA的分布。甲基綠-派洛寧法原理：甲基綠—派洛寧（methylgreen-pyronin）為堿性染料，它分別能與細胞內(nèi)的DNA、RNA結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色。當(dāng)甲基綠與派洛寧作為混合染料時，甲基綠與染色質(zhì)中DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍色；派洛寧與核仁、細胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用，同時兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色。而派洛寧則與聚合程度較低的RNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色（但解聚的DNA也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn)紅色）。即RNA對派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對甲基綠親和力大，被染成綠色。Giemsa染色法原理：Giemsa\o"吉姆薩染液"染液由天青，伊紅組成，染色原理和結(jié)果與瑞特染色法基本相同。嗜酸性顆粒堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果染成粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；\o"細胞核"細胞核蛋白和\o"淋巴"淋巴細胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍或天青結(jié)合染成紫藍色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍均可結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。結(jié)果：MGG染色將細胞核染成紫紅色，細胞質(zhì)和核仁染成藍紫色。蘇木精-伊紅（HE)染色原理：DNA兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽離子結(jié)合使胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明對比。結(jié)果：細胞核呈藍色，細胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細菌可呈藍色或紫藍色。四、蛋白質(zhì)細胞化學(xué)堿性蛋白與酸性蛋白顯示以酸性氨基酸成分為主的蛋白質(zhì)為酸性蛋白；以堿性氨基酸為主的蛋白質(zhì)為堿性蛋白。細胞核內(nèi)有組蛋白（堿性蛋白）及少量酸性蛋白，細胞質(zhì)中主要有酸性蛋白，標本經(jīng)三氯醋酸處理抽提掉核酸后，用不同PH值的快綠染液分別染色，使細胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來。酸性磷酸酶顯示當(dāng)酸性磷酸酶與含有磷酸酶的作用底物一起保溫時，能水解磷酸酯使其釋放出磷酸基，磷酸基僅為與底