帶蒂筋膜瓣包裹超臨界骨缺損的實驗研究

帶蒂筋膜瓣包裹超臨界骨缺損的實驗研究

骨缺損的臨床治療難度大，治愈率高。膜引導(dǎo)骨再生(membrancguidedboneregeneration,MGBR)技術(shù)為目前臨床修復(fù)超臨界骨缺損(exceedcriticalsizedefect,ECSD)的研究熱點,其核心問題為屏障膜的選擇及成骨空間的維持,據(jù)此,我們設(shè)計本實驗,論證帶蒂筋膜瓣具有MGBR作用且其包裹非細胞型組織工程化骨(noncelluartissueengineeredbone,NTEB)填充骨缺損,對促進骨ECSD修復(fù)是可行的且療效明顯。1材料和方法1.1骨誘導(dǎo)活性材料4~5月齡新西蘭大白兔50只,雌雄不限,體重2.0~2.5kg;骨誘導(dǎo)活性材料(osteoinductiveabsorbingmaterial,OAM);骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)。1.2透射光密度計BX51顯微鏡;Konica190X線機;Pehamed-Densoquick2型透射光密度計;超速離心機;生物力學(xué)試驗機BOSE3520-AT型。1.3方法1.3.1復(fù)合自體骨髓基質(zhì)聯(lián)合細胞nm的制備將50只兔行放血干預(yù)動員,5d后抽取自體紅骨髓(autologousredbonemarrow,ARBM)8mL。經(jīng)離心純化稀釋處理,獲得濃度為1×108個/mL的單核細胞懸液2mL,浸泡經(jīng)處理的合適大小OAM10min后,將復(fù)合自體骨髓基質(zhì)干細胞(bonemarrowstemcell,BMSC)的OAM制備成NTEB。經(jīng)測定自體BMSC在OAM中含量為2×107個/cm。1.3.2帶蒂肌力瓣的nteb所有動物隨機分為A、B兩組,每組25只;無菌手術(shù)造右尺骨中段2cm骨缺損,植入修整后的NTEB,A組單純植入NTEB,B組以帶蒂筋膜瓣呈圓桶狀包裹NTEB1圈固定;逐層縫合,肢體未行固定,常規(guī)喂養(yǎng),16萬U硫酸慶大霉素肌注3d,1次/d。1.4觀察指標(biāo)1.4.1一般情況下1.4.2放射學(xué)檢查術(shù)后4、8、12、16周攝兔右尺橈骨正位X線片,動態(tài)觀察NTEB吸收降解及新骨再生情況。1.4.3一般觀察和學(xué)校研究術(shù)后4、8、12、16周每組各處死4只動物取材,觀察NTEB表面大體變化及骨缺損部位成骨情況。1.4.4織學(xué)評分法檢測新生骨小梁面積根據(jù)LaneSandhu骨移植物組織學(xué)評分法,術(shù)后4、8、12、16周在圖像分析儀下進行組織形態(tài)分析,測定新生骨小梁面積占修復(fù)區(qū)面積的比值。1.4.5生物力學(xué)評價的分析術(shù)后8、12、16周,每組3只動物解剖取新鮮尺骨骨干,作三點彎曲生物力學(xué)測定,記錄所需載荷。1.5統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析,兩兩比較采用q檢驗,P<0.05時為差異有顯著性。2結(jié)果2.1一般情況下術(shù)后7d內(nèi)動物一般狀況差;B組較A組前肢功能恢復(fù)快,表現(xiàn)為術(shù)后2周開始重度跛行,4周輕度跛行,8周恢復(fù)術(shù)前狀態(tài)。2.2植入物密度及骨干結(jié)構(gòu)X線片檢查示,術(shù)后4周A組植入物密度稍低,骨斷端間隙清晰;B組植入物密度明顯降低,骨斷端間隙已不明顯,少許外骨痂形成。術(shù)后8周,A組植入物密度較低,間隙仍明顯,無外骨痂形成;B組植入物周邊有板層狀或梭形規(guī)則阻射影,材料部分降解,植入物與尺骨斷端間隙消失。術(shù)后12周,A組有外骨痂形成并包裹植入物;B組初步形成骨干結(jié)構(gòu),骨皮質(zhì)連續(xù),部分髓腔再通。術(shù)后16周,A組植入物降解較明顯,再生新骨形成少,初步形成骨干結(jié)構(gòu),但骨皮質(zhì)不連續(xù),髓腔不通;B組植入物完全降解,正常骨干結(jié)構(gòu)形成,骨髓腔完全再通(圖1)。2.3術(shù)后骨髓組織結(jié)構(gòu)觀察A組:術(shù)后4周,可見交界區(qū)纖維結(jié)締組織連接,鏡下大量纖維結(jié)締組織長入,散在有軟骨細胞,新生骨小梁極少;8周時纖維結(jié)締組織在新生骨小梁結(jié)構(gòu)內(nèi)延伸,散在有軟骨細胞團及異物巨細胞反應(yīng);12周骨痂生長紊亂,交界區(qū)間隙不明顯,鏡下見紊亂的纖維性骨痂,骨小梁結(jié)構(gòu)形成較少;16周時植入物部分降解且再生新骨極少,但與骨干形成一個整體,鏡下見交界區(qū)纖維結(jié)締組織依然存在,植入物內(nèi)有發(fā)育較成熟的骨小梁,髓腔未通。B組:術(shù)后4周,筋膜瓣形成骨膜樣組織,膜下修復(fù)區(qū)軟骨樣組織連接,鏡下骨膜樣結(jié)構(gòu)阻擋周邊軟組織進入修復(fù)區(qū),植入物降解明顯且散在發(fā)育中骨小梁和軟骨細胞團,未見淋巴細胞浸潤;8周骨膜樣組織下骨痂形成且包裹植入物,鏡下見植入物內(nèi)部有發(fā)育較成熟的骨小梁骨及軟骨組織;12周新骨生成較多,與骨干形成一個整體,鏡下見植入物接近完全降解,有大量成熟骨小梁形成并層狀整齊排列,骨髓腔部分再通;16周時筋膜瓣形成似骨膜樣組織,修復(fù)區(qū)骨皮質(zhì)連續(xù),骨干結(jié)構(gòu)重塑,鏡下見植入物已降解,由新骨替代,新骨中散在少量軟骨,成熟骨結(jié)構(gòu)形成,骨髓腔再通(圖2)。2.4修復(fù)區(qū)域內(nèi)骨形態(tài)的測量分析術(shù)后各時間點兩組新生骨小梁面積占鏡下修復(fù)區(qū)面積的比值比較,及組內(nèi)不同時間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。2.5兩組力學(xué)強度測定術(shù)后同一時間點經(jīng)修復(fù)的尺骨三點彎曲生物力學(xué)測定顯示B組力學(xué)強度明顯大于A組,差異有顯著性(P<0.05),同組不同時間點前后比較,差異有顯著性(P<0.05)(表2)。3討論3.1骨膜樣組織的形成帶蒂筋膜瓣為深筋膜與皮下真皮血管網(wǎng)之間的組織膜,制取技術(shù)成熟且本身血供豐富,設(shè)計靈活性大。通過本實驗,B組4周時筋膜瓣貼附于組織工程骨表面,形成半透明的骨膜樣組織;16周時骨膜樣組織依然存在且其阻止周圍纖維結(jié)締組織進入骨缺損修復(fù)區(qū)作用明顯(圖2);而A組同期未見骨膜樣組織形成。證明帶蒂筋膜瓣作為MGBR的屏障膜可行,其引導(dǎo)NTEB再生新骨明顯。3.2修復(fù)區(qū)的骨作用通過本次試驗觀察,NTEB對成骨空間的維持作用明顯。其在體內(nèi)開始降解的時間不少于4周,完全降解的時間至少為12周,滿足MGBR技術(shù)的要求;帶蒂筋膜瓣與NTEB結(jié)合在促成骨方面作用明顯。NTEB提供BMSC生長支架,控制BMP釋放,且在帶蒂筋膜瓣形成的成骨空間內(nèi),局部聚積,保證了BMSC和BMP濃度;同時,BMP誘導(dǎo)下不僅可提高OAM單位體積內(nèi)BMSC、成骨細胞的數(shù)量和活性,還能夠在修復(fù)區(qū)內(nèi)外高效誘導(dǎo)血管周圍的間充質(zhì)細胞或BMSC,增殖轉(zhuǎn)化為軟骨細胞和成骨細胞,并以軟骨化骨為主、膜內(nèi)化骨為輔形成新骨。通過修復(fù)區(qū)成骨情況觀察,B組在植入物降解、新生骨形成、骨斷端交界區(qū)連接、骨干正常結(jié)構(gòu)形成、骨髓腔再通等方面均優(yōu)于A組,表現(xiàn)為術(shù)后的療效即術(shù)后B組實驗動物前肢功能較A組恢復(fù)早,說明B組植入物早期起到機械支撐和增加力學(xué)強度,后期經(jīng)生物降解而形成新骨,起到了良好的骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)和骨支撐三重作用。通過組織學(xué)觀察,B組隨著時間的推移植入物周邊及內(nèi)部骨小梁和軟骨細胞團增多明顯,且大量成熟骨小梁形成,NTEB完全降解,骨髓腔再通,而同一時間段A組成骨作用較差。根據(jù)修復(fù)區(qū)內(nèi)骨形態(tài)計量分析(見表1),B組骨小梁體積明顯大于A組,且同一組不同時間點評分,隨著時間的推