DB50-T 1460-2023地方豬耳緣成纖維細胞制備與凍存技術規(guī)范

ICS65.020.30CCSB43

DB50重 慶 市 地 方 標 準DB50/T1460—2023地方豬耳緣成纖維細胞制備與凍存技術規(guī)范2023-09-152023-09-152023-12-15重慶市市場監(jiān)督管理局??發(fā)布DB50/T1460DB50/T1460—2023前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出、歸口并組織實施。本文件起草單位：重慶市畜牧科學院、重慶市畜牧技術推廣總站、四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學院。本文件主要起草人：龍熙、潘紅梅、朱燕、郭宗義、張亮、周旗、任素碧、涂志、柴捷、易霞。IIDB50/T1460DB50/T1460—2023DB50/T1460—20235.2實驗用水及相關溶液5.2.1實驗用水。應符合DB50/T1460—20235.2實驗用水及相關溶液5.2.1實驗用水。應符合GB/T6682中4.2二級水要求。5.2.2樣品培養(yǎng)及保存液。樣品培養(yǎng)及保存液配制方法見附錄A。6采樣要求地方豬耳緣成纖維細胞制備與凍存技術規(guī)范范圍本文件適用于地方豬耳緣成纖維細胞制備和凍存。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T541 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范NY/T3075 畜禽養(yǎng)殖場消毒技術術語和定義下列術語和定義適用于本文件。下列術語和定義適用于本文件。3.1耳緣成纖維細胞earmarginfibroblasts取自豬耳緣部位的組織，通過分離培養(yǎng)，獲得的成纖維細胞。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DMEM：杜氏培養(yǎng)基（Dulbecco'smodifiedeaglemedium）DPBS：杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco'sPhosphate-BufferedSaline）DMSO：二甲基亞砜（DimethylSulfoxide）5試驗材料、儀器設備主要儀器設備及耗材消毒用品。75%酒精、碘伏。防護用品。防護服、口罩、無菌帽、橡膠手套等。實驗用具。耳缺鉗、剪刀、鑷子、刀片、細胞培養(yǎng)皿（瓶）、離心管、酒精燈、巴斯德吸管等。1采樣豬只應為健康活體。瀕危豬種可在死亡后24h內(nèi)采樣。采樣用具應無菌。NY/T541的要求。NY/T3075執(zhí)行。樣品采集選擇耳緣避開大血管的較薄部位消毒，用耳缺鉗取長寬5mm～6mm的樣品。75%30sDPBS將樣品上的酒精沖洗干凈，再移至加有DMEM的離心管中，封口、標記，放入低溫保存箱。在采樣登記表（見附錄B）上登記。采樣結束，樣品即送實驗室。廢棄物應無害化處理。樣品處理在超凈工作臺中，將樣品轉移至加有75%酒精的離心管中震蕩搖晃30s，用DPBS清洗，去除毛發(fā)和表皮，再用DPBS將樣品清洗干凈。將經(jīng)8.175%30sDPBS清洗干凈。分離培養(yǎng)原代細胞1mm3（瓶（瓶）底。將培養(yǎng)皿（瓶）37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h～6h2h觀察1次。（瓶4mL37DMEM，12h后觀察是否污染，若有污染丟棄或二次清洗。1d觀察細胞遷出及其生長狀況。標記細胞處理方式和細胞狀態(tài)，記錄細胞分離培養(yǎng)日志（C）。傳代細胞70%～90%時，進行傳代培養(yǎng)。9.2.1（瓶DPBS2～3（瓶1mL3（瓶22mLDMEM000rpm離心5min，留細胞沉淀。加入DMEM重懸細胞，取細胞懸液均勻接種于2個細胞培養(yǎng)皿（瓶）中，標記為P1代細胞，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2d換1DMEM。細胞匯合度為70%～90%時，進行下一次傳代。標記細胞處理方式和細胞狀態(tài)，記錄細胞分離培養(yǎng)日志（見附錄C）。凍存（瓶37DPBS1～29.2.2操作1次。20℃～251~5×106個/mL。凍存管分裝，標記細胞來源、代次與凍存日期。將分裝好的細胞凍存管放入程序降溫盒，-808h～16h做好凍存記錄。33DB50/T1460—2023DB50/T1460—2023DB50/T1460—2023DB50/T1460—2023附錄A（規(guī)范性）樣品培養(yǎng)及保存液配制方法單個樣品保存液配制10LDEM500μL1L10--0.22μm，421d。DPBS8g氯化鈉，0.2g氯化鉀，1.15g磷酸氫二鈉，0.2g1LddH2O中。過濾除菌（0.22μm）421d。DMEM（+101×抗生素）配制500mLDMEM+56mL胎牛血清+5.6mL100×青霉素-鏈霉素-兩性霉素，混勻后過濾除菌（0.22μm），不得高壓滅菌。配制完成后于4℃保存，有效使用期不超過21d。細胞冷凍液配制70mLDMEM+20mL胎牛血清+10mLDMSO，混勻后過濾除菌（0.22μm），不得高壓滅菌。配制完成后于421d。44附錄B（資料性B.1采樣登記表。表B.1