第五章植物人工繁殖

第5章植物人工繁殖☆概念

它是為了克服自然有性生殖的不足，滿足對優(yōu)良植物大量的需要，通過組織培養(yǎng)、人工種子、胚胎培養(yǎng)等方法實現(xiàn)植物的快速繁殖。一植物人工繁殖☆植物無性繁殖過程中植株再生的發(fā)生方式：1、不定芽型：選取具有頂芽和腋芽的短枝無菌培養(yǎng)，誘導腋芽萌發(fā)成苗。技術(shù)關(guān)鍵是打破頂端優(yōu)勢，促進腋芽增殖并促其生根。特點（1）繁殖率高；（2）能保持植物的遺傳穩(wěn)定性；（3）可縮短林木的繁殖周期。

2、器官型：直接從莖、葉、鱗片等外植體上誘導不定芽，或者從帶芽休眠器官上再生植株。技術(shù)關(guān)鍵是要求較高的培養(yǎng)基，需控制激素濃度，避免愈傷組織發(fā)生。特點（1）繁殖率非常高，但繁殖速度慢；（2）遺傳穩(wěn)定。3、器官發(fā)生型：外植體誘導形成愈傷組織，再誘導生根或生芽再生植株。特點（1）繁殖速度快；（2）遺傳性不穩(wěn)定，易產(chǎn)生變異。4、胚狀體發(fā)生型：外植體誘導形成胚狀體再生植株。技術(shù)關(guān)鍵是提高不同外植體的胚狀體發(fā)生及萌發(fā)率，提高胚狀體的同步化率。特點（1）繁殖速度快，繁殖率高；（2）遺傳性穩(wěn)定。5、圓球莖型：外植體誘導形成圓球莖，再直接再生植株。圓球莖是蘭花種子萌發(fā)時產(chǎn)生的呈珠粒狀、縮短的、類似嫩莖的器官。二、植物組織培養(yǎng)在無菌和人為控制外因的條件下，培養(yǎng)、研究植物組織器官，甚至進而從中分化、發(fā)育出整個植株的技術(shù)。非試管的微組織快繁和試管組織培養(yǎng)。（一）、發(fā)展史

1902年，德國植物學家哈伯蘭特（G.Haberlandt）最早進行植物細胞培養(yǎng)的試驗，被譽為“植物組織培養(yǎng)之父”；1904年，hanning，在無機鹽和蔗糖溶液中培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚,最先將幼胚培養(yǎng)技術(shù)應用于育種實踐的植物細胞工程。1922年，美國、德國分別報導了離體根尖的培養(yǎng)；1934—1939年，先后發(fā)現(xiàn)了各種生長素，并利用番茄、胡蘿卜的離體培養(yǎng)，初步建立起較為成熟的細胞培養(yǎng)方法，使植物細胞培養(yǎng)進入一個嶄新的時代；

1941.荷蘭j.vanoverbeek證明椰子乳汁的活性成分可在體外促進其他種類細胞的分裂和生長。1943年，美國懷特（White）提出植物細胞具有全能性1948.中國植物生理學家崔徵和美國科學家合作發(fā)現(xiàn)腺嘌呤和生長素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。1954.skoog發(fā)現(xiàn)DNA降解物中含有細胞分裂和生長的活性物質(zhì)。后被命名為激動素。50年代主要在培養(yǎng)方法方面做了一系列卓有成效的工作，使細胞培養(yǎng)技術(shù)日臻成熟；White、Gautheret、Nobecourt

等科學家被譽為植物組織培養(yǎng)的奠基人。

在此基礎上建立了植物組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，包括無機鹽成分、有機成分和生長刺激因素。這是隨后創(chuàng)立的各種培養(yǎng)基的基礎，同時也建立了植物組織培養(yǎng)的基本方法，成為當今各種植物組織培養(yǎng)的技術(shù)基礎1960年，Morel提出了利用莖尖離體快速繁殖蘭花的方法，在此基礎上，國際上建立了蘭花工業(yè)，取得了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。

1971年，Takebe

等從煙草原生質(zhì)體得到再生植株，首次獲得原生質(zhì)體植株再生成功。

1972年，Carlson

等通過兩個煙草物種原生質(zhì)體的融合，獲得了第一個體細胞雜種植株。1973年，Nitch采用花藥預培養(yǎng)的方法，首次獲得了煙草花粉植株。

1978年，Melchers進行了馬鈴薯和番茄的融合實驗，獲得了第一個屬間雜種植株

到目前為止，組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、細胞融合已在許多植物上獲得再生成功。

（二）、植物組織培養(yǎng)的理論基礎

1、植物的無性繁殖被子植物的兩種繁殖方式：有性繁殖和無性繁殖。無性繁殖特點：A、不發(fā)生遺傳重組，后代與親代在遺傳上完全一致；B、可短期內(nèi)獲得大量后代；C、繁殖方式多樣化：營養(yǎng)器官再生、營養(yǎng)器官變態(tài)、落地生根等2、細胞的全能性

生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能，細胞的這種特性叫做細胞的全能性。表現(xiàn)全能性的基礎和條件基礎：生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳信息，都有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個活細胞都應該具有全能性。條件：離體，提供營養(yǎng)物質(zhì)，激素，其他適宜條件（如溫度等）在高等動物中，受精卵細胞、早期卵裂細胞、囊胚期細胞具有全能性幾乎所有植物的體細胞，雌、雄配子體都具有全能性，都能發(fā)育成胚和植株受精卵>生殖細胞>體細胞植物細胞全能性的差異：根據(jù)細胞所處的組織不同從強到弱為：頂端分生組織>居間分生組織>側(cè)生分生組織>薄壁組織(基本組織)>厚角組織>輸導組織>厚壁組織。

在生物體內(nèi)，由于基因的選擇性表達，細胞不能表現(xiàn)出全能性，而是分化成為不同的組織器官。當已分化的植物器官、組織或細胞脫離母體后，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素等外界條件作用下分化形成愈傷組織（一種相對沒有分化的細胞團），繼而在植物激素等誘導下發(fā)生再分化，才能表達出全能性，發(fā)育成完整植株。3、植物細胞的脫分化和再分化（1）細胞分化細胞分化細胞分化也可以說是相同基因型的細胞所具有的各個不同的表現(xiàn)型。它包括：時間上的分化：一個細胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能；空間上的分化：對于多細胞生物來講，同一細胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。細胞分化是一個復雜的生物化學過程，有復雜的調(diào)控機制。營養(yǎng)物質(zhì)和激素的種類和配比能深刻影響分化過程，光照則是許多細胞分化的必需條件細胞的脫分化脫分化：離體培養(yǎng)條件下，一個已分化的細胞回復到原始無分化狀態(tài)或分生組織細胞狀態(tài)或胚性細胞的狀態(tài)的過程就是細胞脫分化愈傷組織是細胞脫分化的結(jié)果已經(jīng)脫分化的細胞或組織在一定條件下，它們又可以經(jīng)過胚狀體(由體細胞形成的類似合子胚的結(jié)構(gòu))或愈傷組織再分化出芽和根，從而發(fā)育成一個完整的植株。激素則是在一定條件下能打破操縱基因的控制，使結(jié)構(gòu)基因活化。因此，它直接影響和控制細胞的分化。（2）細胞的再分化和器官發(fā)生再分化：脫分化后的分生細胞（愈傷組織）在特定的條件（離體培養(yǎng)）下，重新恢復細胞分化能力，并經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，進一步發(fā)育成完整生物體，這一過程稱為細胞再分化。切取接種愈傷組織的形成分化形成小芽或根試管苗的形成移栽

成熟細胞分生細胞愈傷組織器官發(fā)生胚狀體發(fā)生再生植株→→↗↘→→脫分化分裂→再分化高等植物細胞脫分化與再分化示意圖（3）植物組織再分化的兩條途徑，一是由愈傷組織的部分細胞先分化產(chǎn)生芽（或根），再在另一種培養(yǎng)基上產(chǎn)生根（或芽），形成一個完整的植株，因為芽和根都是植物體的器官，所以這一過程叫器官發(fā)生途徑。另一個是在愈傷組織中產(chǎn)生出一些與種子胚相似的結(jié)構(gòu)，即同時形成一個有苗端和根端的兩極性結(jié)構(gòu)，然后再在另一種培養(yǎng)基上同時發(fā)展成帶根苗，由于這一過程與種子中胚的形成和種子萌發(fā)時形成幼苗的過程相似，所以叫做胚狀體發(fā)生或無性胚胎發(fā)生。（4）幾個重要概念

外植體〔explant〕：從植物體上分離下來的用于離體培養(yǎng)的材料。

分化〔differentiation〕：細胞在分裂過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，從而在個發(fā)育中形成各類組織和器官完成整個生活周期。

脫分化〔dedifferentiation〕:已分化好的細胞在人工誘導條件下，恢復分生能力，回復到分化組織狀態(tài)的過程。

再分化〔redifferentiation〕:脫分化后具有分生能力的細胞再經(jīng)過與原來相同的分化過程，重新形成各類組織和器官的過程。

愈傷組織〔callus〕:在離體培養(yǎng)過程中形成的具有分生能力的一團不規(guī)則細胞，多在外植體切面上產(chǎn)生。

胚狀體〔embroid在離體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生一種形似胚（具有明顯的根端和芽端），功能與胚相同的結(jié)構(gòu)。

繼代培養(yǎng)：更換新鮮培養(yǎng)基來繁殖同種類型的材料（愈傷組織.芽等）。

（5）影響植物細胞脫分化和再分化因素：內(nèi)部因子：植物的遺傳性狀、生理狀況。外部因子：營養(yǎng)條件（植物激素、無機鹽、有機營養(yǎng)成分等）、環(huán)境條件（培養(yǎng)基的ph、滲透壓、溫度、濕度、光照等）。不同程度的影響植物細胞脫分化、再分化及器官建成的各個過程。細胞分裂素生長素根分化芽分化愈傷組織愈傷組織再分化過程應先誘導生芽，再誘導生根當細胞分裂素與生長素濃度比高時，有利于芽的發(fā)生；濃度比低時，有利于根的發(fā)生。

植物生長物質(zhì)的添加量生長素(mg/L)330.030細胞分裂素0.20.0210.2

(mg/L)其它影響植物細胞脫分化與再分化的條件物理因素：切割造成的機械和生理隔離，切割創(chuàng)傷產(chǎn)生的物質(zhì)?；瘜W因素：化學試劑，輻射處理。（三）植物組織培養(yǎng)程序

利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可研究被培養(yǎng)部分（外植體）在不受植物其它部分干擾下的生長和分化規(guī)律，并可以用各種培養(yǎng)條件影響它們的生長和分化，以解決理論和生產(chǎn)中的問題植物組織培養(yǎng)條件：含有全部營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基、一定的溫度、空氣、無菌環(huán)境、適合的PH、適時光照等。1實驗材料的清洗和消毒（1）清洗實驗材料必須嚴格清洗，清洗過程勿傷實驗材料。（2）消毒清洗藥劑滅菌法適用于培養(yǎng)材料的表面消毒。外植體在接種之前，須經(jīng)嚴格地滅菌。由于滅菌劑的種類不同，殺菌力不同，因此選擇消毒劑，既要考慮具有良好的消毒殺菌作用，同時又易被蒸餾水沖洗掉或能自行分解的物質(zhì)，且不會損傷或只輕微損傷組織材料而不影響生長。在使用不同的藥劑時，需要考慮使用濃度和處理時間。對一些特殊生物特性的植物材料需要特殊的處理。表面具較厚蠟質(zhì)和角質(zhì)層的，滅菌劑不易粘著，可加入少量表面活性劑。對器官外植體的滅菌，一般采用多種藥劑配合使用的方法。不同器官的滅菌順序

(1)莖尖、莖段及葉片等的消毒：用清潔劑清洗---70%酒精浸泡10-20min---無菌水洗2-3次---Naclo或升汞溶液泡10-15min---無菌水洗3-4次（2）果實和種子的消毒：自來水沖洗10-30min---70%酒精漂洗---2%Naclo液浸10min---無菌水2-3次---取出種子培養(yǎng)（3）根及地下部器官的消毒：自來水沖洗---純酒精漂洗---升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min---無菌水洗3次（4）花藥的消毒：70%酒精浸泡數(shù)秒鐘---無菌水洗2-3次---漂白粉上清液浸10min---無菌水洗2-3次.

一般情況下，如果外植體較大而且硬，可直接用消毒劑處理，如果實、葉片、莖段、種子等的消毒；如果是幼嫩的莖尖，一般先取較大的莖尖，表面消毒后，再在無菌條件下借助解剖顯微鏡取出需要的莖尖培養(yǎng)；如果是未成熟胚、胚珠、胚乳、花藥等，一般先把子房或胚珠、花蕾表面消毒，再在無菌條件下剝出需要的外植體；如果是細胞，應按培養(yǎng)目的，選擇合適的起始材料進行相應的外植體消毒。如果外植體表面污染嚴重，需流水沖洗1h或更長時間，或者先通過種子培養(yǎng)得到無菌種苗，然后再用其它各個部分建立組織培養(yǎng)。2培養(yǎng)基培養(yǎng)基是植物細胞、組織和器官離體培養(yǎng)所需的營養(yǎng)基質(zhì)，其中含有植物細胞生長分化所必需的各種營養(yǎng)成分和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。培養(yǎng)基成分的篩選和優(yōu)化是植物組織培養(yǎng)中非常重要的步驟培養(yǎng)基的組成

除了C、H、O之外，需要量比較多的元素叫大量元素，每升幾十至幾千毫克，包括N,

P,

K,

Ca,

Mg,

S。需要量比較少的元素叫微量營養(yǎng)元素，包括Fe、Cu、Zn、B、

Mo、Mn、Co，Cl。

植物所需的微量元素有其他一些化學藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注意微量元素的用量不能過多，多會引起生長抑制等毒害現(xiàn)象。

（1）無機營養(yǎng)成分

（2）有機化合物

有機物質(zhì)包括維生素類物質(zhì)、氨基酸類物質(zhì)、糖類物質(zhì)和一些其它的有機添加物

*維生素類物質(zhì)

硫胺素（VB1）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素；而鹽酸吡哆醇（VB6）促進根的生長，煙酸（VB3，又稱維生素PP）促進胚的發(fā)育；常用的還有VB5、生物素（VH）、鈷胺素（VB12）、葉酸（VBc），Vc等。

*AA類物質(zhì)

常用的有Gly、Asn、Gln。在植物組織培養(yǎng)中，有時也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。

*糖類

糖在培養(yǎng)基的作用：為細胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架，為細胞的呼吸代謝提供底物和能量，維持滲透壓。

蔗糖是廣泛應用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。

*其它有機物質(zhì)

肌醇（環(huán)己六醇）

肌醇可以形成果膠物質(zhì)，利于胚和芽的形成

天然有機物

椰乳、番茄提取物、酵母提取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表現(xiàn)出了良好的促進作用。

（3）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

無機元素和有機營養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動，只有加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導細胞分裂、脫分化和再分化。

A、生長素類：

吲哚類：IAA（吲哚乙酸）、

IBA（吲哚丁酸）

、IPA（吲哚丙酸）萘酸類：

NAA（萘乙酸）

苯氧羧酸類：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（

2,4,5-三氯苯氧乙酸）、

2,4,5-TP（

2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。

其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強的生長素。

生長素的生理作用

1）、促進細胞生長和細胞分裂

2）、誘導受傷組織表面細胞恢復分裂能力

3）、形成愈傷組織，促進生根

4）、與一定量的細胞分裂素配合共同誘導不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長、胚狀體的誘導。B、細胞分裂素類

是一類腺嘌呤衍生物。主要有激動素（

6-糠基氨基嘌呤KT）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6—芐基氨基嘌呤。

細胞分裂素類功能：

1）、促進細胞的分裂和分化

2）、誘導芽的分化

3）、促進側(cè)芽的萌發(fā)和生長

4）、抑制衰老

C、赤霉素（GA3）

D、脫落酸（ABA）

（4）固化劑和懸浮劑

A、固化劑

瓊脂、瓊脂糖，瓊脂的用量一般在4-10g/L，所購回的瓊脂要先試一下它的凝固力，一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要多加。瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。

B懸浮劑

Ficoll（聚蔗糖）

（5）ph值滅菌之前培養(yǎng)基的ph值一般都要調(diào)節(jié)到5.0—6.0。一般說來：ph高于6時，培養(yǎng)基會變硬；ph低于5時，瓊脂不能很好的凝固。為穩(wěn)定ph值，往往加入ph緩沖劑（mes等）3、培養(yǎng)基的選擇（1）基礎培養(yǎng)基：MS是廣譜性培養(yǎng)基，N6用于單子葉植物的培養(yǎng)，豆科多用B5培養(yǎng)基。

（2）植物生長調(diào)節(jié)劑：必須進行篩選試驗。總體原則-當誘導愈傷組織形成時，細胞分裂素和生長素相對平衡；誘導芽分化時，細胞分裂素水平應高于生長素，誘導根則要低。

（3）有機成分要根據(jù)培養(yǎng)類型考慮，如進行器官和組織培養(yǎng)，一般不加復雜有機成分，而進行細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則要加4、培養(yǎng)基的配制最簡單方法是用市售培養(yǎng)基干粉，其中含有無機鹽、維生素、和氨基酸。把這種干粉溶解在蒸餾水里（比培養(yǎng)基的最終容積少10%），加上瓊脂和其他必要的補加物，再加入蒸餾水使之達到最終容積，調(diào)節(jié)ph，高壓滅菌，制成所需的培養(yǎng)基。1.按照配方規(guī)定的數(shù)量稱量出各種成分，分別使之溶解于水，然后混合。2.先配制出一系列濃縮儲存液，包括大量元素（濃縮20倍）、微量元素（濃縮200倍）、鐵鹽（濃縮200倍）、和蔗糖之外的有機物質(zhì)（濃縮200倍），然后彼此混合。注意每種成分分別溶解，一粒不剩。制備儲存液和培養(yǎng)基的時候，應使用蒸餾水或無離子水，以及高純度的化學試劑。制備過程全部步驟：稱取規(guī)定數(shù)量的瓊脂和蔗糖，加水至培養(yǎng)基最終容積的3/4。加熱溶解；分別加入各種儲存液，包括生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他特殊補加物；加蒸餾水至培養(yǎng)基的最終容積；混合后調(diào)節(jié)ph；分裝培養(yǎng)基；用棉塞封口；高壓滅菌；培養(yǎng)基室溫冷卻，至4℃冰箱中保存。5、接種接種是經(jīng)過表面滅菌的實驗材料，按照不同的要求，移至培養(yǎng)基上培養(yǎng)的過程。接種過程必須嚴格進行無菌操作一防止雜菌污染。接種的操作步驟1)玻璃瓶中放置植物組織塊。消毒液消毒。需搖動玻璃瓶2-3次2)無菌蒸餾水清洗，3-4次3)取出材料置于無菌培養(yǎng)皿。4)進行1)時，消毒所要使用器械。蘸入70%酒精，取出火焰灼燒，冷卻后可用，每次使用后消毒一次。5)用消毒后的器械切取適當外植體。6)接種外植體于培養(yǎng)基上，移入培養(yǎng)室培養(yǎng)。污染的預防1)接種室要經(jīng)常滅菌。2)超凈臺使用前要70%酒精消毒或紫外照射滅菌。每次操作前所有物品先放入臺內(nèi)，勿中途拿入。臺面放置東西不宜太多。3)操作人員接種前需肥皂水洗手，穿干凈工作服，70%擦手和臺面。接種器械70%酒精浸泡，火焰灼燒滅菌。操作時禁止講話。4)接種打開包頭紙時不要污染瓶口。三、體細胞胚胎發(fā)生與人工種子（一）體細胞胚胎發(fā)生愈傷組織原來是指植物受損傷時在愈合傷口處長出的一團瘤狀突起，突起內(nèi)的細胞已發(fā)生脫分化的變化。培養(yǎng)中的愈傷組織是指從外植體的內(nèi)部或切口表面形成的一團沒有分化的均勻一致、無序生長的薄壁細胞團。這種組織具有再分化的能力。1、愈傷組織的誘導

愈傷組織的形成大致要經(jīng)過起動期、分裂期和形成期三個階段。1）起動期當外植體已分化的活細胞在外源植物生長物質(zhì)的作用下，通過脫分化起動而進入分裂時期，進而形成愈傷組織。此期的細胞大小無明顯變化，胞內(nèi)RNA含量迅速明顯增加，細胞核變大。2）分裂期是指細胞通過一分為二的方式不斷增生子細胞的過程。外植體的細胞一旦經(jīng)過誘導，其外層細胞開始細胞分裂，使細胞脫分化。此期細胞分裂快、結(jié)構(gòu)疏松、缺少組織結(jié)構(gòu)。3）形成期是指外植體細胞經(jīng)過誘導、分裂形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織時期。此期細胞大而不規(guī)則、高度液泡化、無次生細胞壁和胞間連絲，整個組織結(jié)構(gòu)較松散；表面以下約5~10個細胞是細胞生長的中心，分生中心的細胞明顯小些，出現(xiàn)了胞間連絲和果膠質(zhì)，這些中心是愈傷組織的主要生長部位。2、愈傷組織器官的發(fā)生愈傷組織在某些條件下可以通過器官發(fā)生的再分化途徑產(chǎn)生不定芽和根或胚狀體，然后再發(fā)育成苗或完整的小植株。A不定芽方式不定芽方式是指愈傷組織培養(yǎng)物，通過形成不定芽再生成植株。這是愈傷組織培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。愈傷組織通過不定芽方式再分化形成再生植株的方式主要有四種。愈傷組織上分別形成無根的芽或無芽的根；愈傷組織上先形成芽，待芽伸長后再在其莖的基部形成根；愈傷組織上先形成根，再在根基部分化形成芽；先愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然后兩者接形成植株。B胚狀體形成的方式

胚狀體形成是指從培養(yǎng)的組織或細胞中直接或間接形成胚胎的生長方式。直接形成胚胎是指在外植體上直接分化出胚狀體；間接形成胚是指在外植體上先分化出胚性愈傷組織，然后由胚性愈傷組織再分化形成胚狀體。（二）、人工種子人工種子是指植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生的體細胞胚包埋在含有營養(yǎng)成分和保護功能的物質(zhì)中，在適宜條件下發(fā)芽出苗。人工種子包括：1）體細胞胚是最里面一層；2）人工胚乳是中間層，含有培養(yǎng)物（即胚狀體）所需的營養(yǎng)成分和某些植物激素；3）人工種皮是最外一層為有機的薄膜包裹，以保護水分免于喪失和防止外部物理力量的沖擊。圖15.3人工種子的結(jié)構(gòu)1、人工種子的制備A、體細胞胚的制備體細胞胚的發(fā)生方式體細胞胚胎（胚狀體）可由表皮細胞、愈傷組織、懸浮細胞、花粉、原生質(zhì)體等發(fā)生：1）來源于外植體的表皮細胞，如石龍芮、刺五加、芹菜等；2）來源于愈傷組織細胞，如玉米、西洋參桃等；3）懸浮培養(yǎng)中由單細胞來源的胚狀體，如胡蘿卜、芹菜等；4）由花藥花粉培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體胚狀體，如曼陀羅、煙草、青椒等；5）來源于原生質(zhì)體的胚狀體，如玉米、黃瓜。體細胞胚胎發(fā)生的同步控制在培養(yǎng)中體細胞胚胎的發(fā)生一般是不同步的?？刂婆郀铙w的同步發(fā)育是人工種子的重要條件。現(xiàn)在常用以下幾種方法對體細胞胚的發(fā)生進行同步控制。1）同步脫分化促進細胞的同步分裂細胞培養(yǎng)初期加入DNA合成抑制劑（如五氨基脲嘧啶），使細胞DNA合成暫時停止。一旦除去DNA抑制劑，細胞開始進入同步分裂。2）不同的溫度處理低溫處理抑制細胞分裂，然后再把溫度提高到正常培養(yǎng)溫度，也能使胚性細胞達到同步分裂的目的。3）利用滲透壓控制胚的同步生長不同發(fā)育階段的胚具有不同的滲透壓要求?？捎谜{(diào)節(jié)滲透壓的方法來控制胚的發(fā)育，使其停留在某一階段，然后同步發(fā)育。

4）分離過篩用不同孔徑的尼龍網(wǎng)過濾或者采用密度離心法來選擇不同發(fā)育階段的胚，然后再轉(zhuǎn)入適宜它們發(fā)育的培養(yǎng)基上，使幼胚繼續(xù)發(fā)育。5）在懸浮培養(yǎng)中控制通氣乙烯的產(chǎn)生與細胞分裂有著密切關(guān)系。在細胞分裂達到高峰前，有一個乙烯合成高峰。B、人工種皮的制備用于人工種皮的材料人工種皮需要滿足下列要求：1）一定得透氣性，不能影響胚狀體的呼吸；2）一定的硬度；3）播種后易于降解；4）含有其他有利于胚狀體存活、生長的成分，對特殊植物還需加入共生微生物以利共生發(fā)芽。體細胞胚包裹的材料

許多凝膠可以作為體細胞胚的包裹材料，如瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽-明膠、淀粉、動物膠、角叉膠等。人工種子包裹方法1）干燥包埋法將胚狀體置于23℃，相對濕度為79%，在黑暗條件下逐漸干燥，然后用聚氧乙烯包裹后貯藏。干燥包埋的體細胞有3%存活下來并發(fā)芽生長。2）凝膠包埋法將胚狀體懸浮在一種黏滯的流體膠中，直接播入土壤。3