第四章-代謝工程的基本思想

代謝工程

MetabolicEngineering第四章代謝工程的基本思想生物合成途徑的遺傳控制2生物發(fā)酵條件的控制2生物發(fā)酵條件的控制3代謝工程基本概念1代謝工程實(shí)例4一、基本概念微生物群體的活動是一個動態(tài)過程伴隨能量形式的轉(zhuǎn)換而發(fā)生的電子流動伴隨異化和同化作用而發(fā)生的物質(zhì)流動伴隨不同水平上的代謝調(diào)節(jié)而發(fā)生的信息流動一、基本概念反應(yīng):途徑:網(wǎng)絡(luò):ABABCDABCED一、基本概念A(yù)BCED反應(yīng)中間代謝物激活的反應(yīng)失活的反應(yīng)底物產(chǎn)物一、基本概念A(yù)BCED交換代謝流胞內(nèi)代謝流代謝流和碳架物質(zhì)流：代謝物在代謝途徑中流動形成代謝流。在代謝工程領(lǐng)域，代謝流往往是指碳架物質(zhì)流一、基本概念代謝主流的變動性和選擇性、載流途徑一、基本概念理想載流途徑一、基本概念代謝網(wǎng)絡(luò)、代謝網(wǎng)絡(luò)的聯(lián)網(wǎng)一、基本概念代謝網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)微生物代謝網(wǎng)絡(luò)中的途徑的交叉點(diǎn)（代謝流的集散處）稱作節(jié)點(diǎn)，在不同條件下，代謝流分布變化較大的節(jié)點(diǎn)稱為主節(jié)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)分為柔性、弱剛性、強(qiáng)剛性節(jié)點(diǎn)代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性微生物自動抵制代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝物流量分布的改變的特性叫做代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性。代謝網(wǎng)絡(luò)的剛性與主要剛性節(jié)點(diǎn)的剛性大小、分布及數(shù)量密切相關(guān)代謝物流分析一種計(jì)算流經(jīng)各種途徑的物流的技術(shù)，用于描述不同途徑的相互作用以及圍繞支點(diǎn)的物流分布一、基本概念代謝控制分析通過某一途徑的物流和以流量控制系數(shù)來表示的酶活之間的定量關(guān)系。流量控制被分布在途徑的所有步驟中，只是若干步驟的流量比其他的更大些，可用數(shù)學(xué)方程來描述代謝網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的控制機(jī)制。流量控制系數(shù)流量的百分比變化除以某一酶活（該酶能引起流量的改變）的百分比變化稱為流量控制系數(shù)彈性系數(shù)表示酶催化反應(yīng)速率對代謝物濃度的敏感性。彈性系數(shù)是個別酶的特性微生物代謝的人工控制微生物在正常情況下，通過細(xì)胞內(nèi)自我調(diào)節(jié)，維持各個代謝途徑的相互協(xié)調(diào)，使其代謝產(chǎn)物既不少又不會過多的積累，而人類利用微生物進(jìn)行發(fā)酵則需要微生物積累較多的代謝產(chǎn)物，為此對微生物的代謝必須進(jìn)行人工控制人工控制微生物代謝的方法主要有兩種改變微生物的遺傳特征控制發(fā)酵條件五字策略：進(jìn)、通、節(jié)、堵、出二、生物合成途徑的遺傳控制二、生物合成途徑的遺傳控制遺傳改造營養(yǎng)缺陷型抗反饋調(diào)節(jié)產(chǎn)物降解酶缺失增加前體物的合成細(xì)胞膜組分缺失營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）：野生型菌株經(jīng)誘變劑處理后，由于發(fā)生了喪失某種酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長的突變菌株野生型（wildtype）：從自然界分離到的、發(fā)生營養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株原養(yǎng)型（prototroph）：營養(yǎng)缺陷型經(jīng)回復(fù)突變或重組，回到原來野生型的營養(yǎng)要求二、生物合成途徑的遺傳控制營養(yǎng)缺陷型終產(chǎn)物D對途徑第一個酶有反饋抑制或阻遏作用。選育失去C——D的能力的D的營養(yǎng)缺陷型突變株，在培養(yǎng)基中添加D使之足以維持生長，但不足引起反饋抑制與阻遏，則解除了D對此途徑的反饋調(diào)節(jié)，那么中間產(chǎn)物C得以大量積累。這類菌株不能積累末端產(chǎn)物，只能積累中間產(chǎn)物無分支途徑二、生物合成途徑的遺傳控制營養(yǎng)缺陷型谷氨酸棒桿菌鳥氨酸生物合成途徑①乙酰谷氨酸合成酶②乙酰谷氨酸激酶③NO乙酰谷氨酸醛脫氫酶④乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶⑤乙酰鳥氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶⑥鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶⑦精氨琥珀酸合成酶⑧精氨琥珀酸酶二、生物合成途徑的遺傳控制營養(yǎng)缺陷型當(dāng)菌株失去C——D的能力即D或E缺陷型突變株。解除了E、G對第一個酶的協(xié)同反饋調(diào)節(jié)。當(dāng)培養(yǎng)基中限量添加E，那么只剩下G對C——F轉(zhuǎn)變的控制。F、G不會過量生成，而使C得以積累分支途徑二、生物合成途徑的遺傳控制營養(yǎng)缺陷型雙缺陷型突變株。F-、D-分支途徑二、生物合成途徑的遺傳控制營養(yǎng)缺陷型菌株失去了F——G的能力，因此限量添加G可以積累F

分支途徑二、生物合成途徑的遺傳控制營養(yǎng)缺陷型通常I、E協(xié)同反饋調(diào)節(jié)途徑第一個酶，但該菌株喪失了C——F的能力，是I、G的雙缺陷型突變株。若在培養(yǎng)基中亞適量添加I、G，那么就解除了I、E對第一個酶的協(xié)同反饋調(diào)節(jié)，使終產(chǎn)物E大量積累，所以只要選育F-或G-、I-缺陷型突變株就可以積累E分支途徑二、生物合成途徑的遺傳控制天冬氨酸甲硫氨酸蘇氨酸賴氨酸中間產(chǎn)物Ⅰ天冬氨酸激酶中間產(chǎn)物Ⅱ抑制高絲氨酸高絲氨酸脫氫酶不能合成營養(yǎng)缺陷型二、生物合成途徑的遺傳控制滲漏缺陷型滲漏缺陷型是一種不完全營養(yǎng)缺陷型，它不會產(chǎn)生過量的末端產(chǎn)物，因而可以避開反饋調(diào)節(jié)。但它又能合成微量的末端產(chǎn)物，用來進(jìn)行生物合成；在培養(yǎng)這種突變體時，可不必在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的物質(zhì)，就能積累所需的產(chǎn)物二、生物合成途徑的遺傳控制抗反饋調(diào)節(jié)在以積累末端產(chǎn)物為目的的發(fā)酵生產(chǎn)中，如果代謝途徑單一無分支，往往不能選用營養(yǎng)缺陷型突變株。要提高產(chǎn)量，最好采用抗反饋調(diào)節(jié)突變株抗反饋調(diào)節(jié)突變株由于基因突變，它們的酶或無活性的原阻遏物不再與末端產(chǎn)物結(jié)合，從而不再發(fā)生酶的變構(gòu)及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再與發(fā)生了突變的操縱基因結(jié)合，因此反饋調(diào)節(jié)被打破，即使在末端產(chǎn)物過量的情況下，也同樣可以積累高濃度的末端產(chǎn)物選育抗結(jié)構(gòu)類似物的突變株從營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株中獲得對途徑中調(diào)節(jié)酶解除反饋抑制的突變株二、生物合成途徑的遺傳控制抗結(jié)構(gòu)類似物抗反饋突變株通?？梢杂锰砑幽┒水a(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物的方法來篩選。末端產(chǎn)物類似物和末端產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，因而能夠引起反饋，但是它們不能參與生物合成在培養(yǎng)基中添加末端產(chǎn)物類似物后，未突變的細(xì)胞將由于代謝途徑受阻而不能獲得生物合成所需的該種末端產(chǎn)物，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。那些對類似物不敏感的突變體，則由于原來受反饋控制的酶的結(jié)構(gòu)，或是酶的合成系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)生了改變，它們不再受抑制或阻遏的影響，在類似物充斥的情況下照常能合成該種末端產(chǎn)物蘇氨酸α-氨基-β-羥基戊酸二、生物合成途徑的遺傳控制回復(fù)突變調(diào)節(jié)酶的變構(gòu)特性是由它的結(jié)構(gòu)基因決定的，若調(diào)節(jié)酶因編碼它的基因發(fā)生突變而失活，則有兩種可能：編碼催化亞基與調(diào)節(jié)亞基的基因發(fā)生了變化編碼催化亞基（或活性部位）的基因發(fā)生變化若通過再次突變，使調(diào)節(jié)酶的活性恢復(fù)，這時又有兩種可能：催化亞基和調(diào)節(jié)亞基恢復(fù)（或大體恢復(fù)）到第一次突變前那樣的狀態(tài)催化亞基得到恢復(fù)，而調(diào)節(jié)亞基卻喪失了調(diào)節(jié)作用，這情況實(shí)質(zhì)上是編碼調(diào)節(jié)亞基的DNA突變，解除了反饋抑制作用調(diào)節(jié)酶的失活與否，可能直接表現(xiàn)為某種營養(yǎng)缺陷型?？梢圆捎脿I養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變的方法，從營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株中獲得對途徑中的調(diào)節(jié)酶解除反饋調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)突變株二、生物合成途徑的遺傳控制產(chǎn)物降解酶缺失為了使產(chǎn)物在發(fā)酵液中穩(wěn)定地存在，以提高發(fā)酵單位，可通過誘變獲得缺乏降解產(chǎn)物酶的突變株原產(chǎn)物生長菌株NTG、DES、UV完全培養(yǎng)基產(chǎn)物為唯一碳源的基本培養(yǎng)基（-）葡萄糖培養(yǎng)基生長因子（+）誘變選育二、生物合成途徑的遺傳控制增加前體物的合成通過選育某些營養(yǎng)缺陷型或結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株以及克隆某些關(guān)鍵酶的方法，增加目的產(chǎn)物的前體合成，有利于目的產(chǎn)物的大量積累二、生物合成途徑的遺傳控制細(xì)胞膜組分缺失生物素缺陷型油酸缺陷型甘油缺陷型溫度敏感突變株添加表面活性劑添加青霉素二、生物合成途徑的遺傳控制細(xì)胞膜組分缺失生物素缺陷型使用生物素缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度控制脂肪酸生物合成，從而控制磷脂的合成作用機(jī)制：生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與脂肪酸的合成，進(jìn)而影響磷脂的合成。當(dāng)磷脂合成減少到正常量的一半左右時，細(xì)胞變形，谷氨酸向膜外漏出，積累于發(fā)酵液中二、生物合成途徑的遺傳控制細(xì)胞膜組分缺失油酸缺陷型使用油酸缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酸培養(yǎng)基中油酸的濃度而控制磷脂的合成作用機(jī)制：由于油酸缺陷突變株阻斷了油酸的后期合成，喪失了自身合成油酸的能力；即喪失脂肪酸生物合成能力，必須由外界供給油酸，才能生長。故油酸含量的多少，直接影響到磷脂合成量的多少和細(xì)胞膜的滲透性；通過控制油酸亞適量，使磷脂合成量減少到正常量的1/2左右時，細(xì)胞變形，谷氨酸分泌于細(xì)胞外二、生物合成途徑的遺傳控制細(xì)胞膜組分缺失甘油缺陷型使用甘油缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，通過限制發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的濃度而控制磷脂的合成作用機(jī)制：甘油缺陷突變株的遺傳阻礙是喪失α-磷酸甘油脫氫酶，所以自身不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必須由外界供給甘油才能生長。在甘油限量供應(yīng)下，由于控制了細(xì)胞膜中與滲透性有直接關(guān)系的磷脂含量，從而使谷氨酸得以積累二、生物合成途徑的遺傳控制細(xì)胞膜組分缺失溫度敏感突變株與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)基因上發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，突變基因所指導(dǎo)翻譯的酶，在高溫時失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變。發(fā)酵過程中，在溫度轉(zhuǎn)換之后，進(jìn)行適度地剩余生長，完成從谷氨酸非積累型細(xì)胞向谷氨酸積累型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，僅通過采用控制溫度就能實(shí)現(xiàn)谷氨酸高產(chǎn)二、生物合成途徑的遺傳控制細(xì)胞膜組分缺失添加表面活性劑表面活性劑作為生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用，導(dǎo)致磷脂合成不足，結(jié)果形成磷脂不足的細(xì)胞膜，提高了細(xì)胞膜對谷氨酸的滲透性添加青霉素抑制轉(zhuǎn)肽酶活性，破壞細(xì)胞壁合成二、生物合成途徑的遺傳控制基因工程基因擴(kuò)增——強(qiáng)化代謝合成途徑異源基因?qū)搿胄碌拇x反應(yīng)基因突變——改變酶學(xué)性質(zhì)基因敲除——阻斷代謝通路代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)與優(yōu)化二、生物合成途徑的遺傳控制三、生物發(fā)酵條件的控制當(dāng)菌株選育（內(nèi)因）確定后，環(huán)境條件（外因）合適與否是發(fā)酵成敗的重要因素。環(huán)境條件既影響微生物生長，又影響代謝速度和方向及產(chǎn)物形成與積累內(nèi)因外因環(huán)境因素對谷氨酸發(fā)酵影響

三、生物發(fā)酵條件的控制發(fā)酵控制要解決的兩個問題發(fā)酵代謝途徑問題---副產(chǎn)物少發(fā)酵代謝速度問題---產(chǎn)物生成速率快調(diào)控發(fā)酵條件包括發(fā)酵溫度、發(fā)酵醪基質(zhì)濃度、含氧量、酸堿度、發(fā)酵時間控制方法有:通風(fēng)、供熱（冷）、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基、流加補(bǔ)料三、生物發(fā)酵條件的控制四、檸檬酸發(fā)酵黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成檸檬酸其生物合成途徑是，葡萄糖經(jīng)EMP、HMP途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA，另一方面經(jīng)CO2固定化反應(yīng)生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸生長期與產(chǎn)酸期都存在EMP與HMP途徑，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4:1黑曲霉檸檬酸產(chǎn)生菌中存在TCA循環(huán)與乙醛酸循環(huán)，在以糖質(zhì)原料發(fā)酵時，當(dāng)檸檬酸積累時，TCA和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱由于TCA和乙醛酸循環(huán)被阻斷或減弱，草酰乙酸是由丙酮酸或磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成的。即由兩個CO2固定化反應(yīng)體系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸為主生物合成途徑四、檸檬酸發(fā)酵發(fā)酵產(chǎn)率無CO2固定反應(yīng)的產(chǎn)率理論產(chǎn)率為：192/(180×1.5)=71.1%有CO2固定反應(yīng)的產(chǎn)率理論產(chǎn)率為：192/180=106.7%正常情況下，檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、無機(jī)磷、銨離子對該酶則有激活作用，特別是還能解除檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶的抑制作用銨離子濃度與檸檬酸生成速度有密切關(guān)系，細(xì)胞內(nèi)銨離子濃度升高，使磷酸果糖激酶對細(xì)胞內(nèi)積累的大量檸檬酸不敏感錳缺乏時，細(xì)胞內(nèi)銨離子濃度高，氨基酸濃度高（蛋白合成受阻，導(dǎo)致升高）。因此，錳離子效應(yīng)是通過升高銨離子而減少檸檬酸對磷酸果糖激酶的抑制來實(shí)現(xiàn)的代謝調(diào)節(jié)糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)四、檸檬酸發(fā)酵糖酵解的代謝調(diào)節(jié)四、檸檬酸發(fā)酵TCA環(huán)的起始酶--檸檬酸合成酶是一種調(diào)節(jié)酶。但在黑曲霉中，檸檬酸合成酶沒有調(diào)節(jié)作用，這是黑曲霉TCA環(huán)的第一個特點(diǎn)順烏頭酸酶失活，阻斷TCA環(huán)是檸檬酸積累的必要條件，順烏頭酸水合酶需要Fe2＋。順烏頭酸酶、異檸檬酸酶在pH2.0時失活。順烏頭酸水合酶在催化時建立了以下平衡：檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7黑曲霉菌體內(nèi)α-酮戊二酸脫氫酶缺失或活力很低，它被葡萄糖和NH4＋抑止（第二個特點(diǎn)）代謝調(diào)節(jié)TCA循環(huán)的調(diào)節(jié)四、檸檬酸發(fā)酵TCA循環(huán)的調(diào)節(jié)四、檸檬酸發(fā)酵氧是發(fā)酵過程（EMP途徑和丙酮酸脫氫）生成的NADH2重新氧化時所需標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈產(chǎn)生ATP積累，側(cè)呼吸鏈不產(chǎn)生ATP，缺氧導(dǎo)致側(cè)呼吸鏈?zhǔn)Щ?，使ATP積累，檸檬酸積累減少當(dāng)缺氧時，只要很短時間中斷供氧，就會導(dǎo)致此側(cè)系呼吸鏈的不可逆失活，而導(dǎo)致檸檬酸產(chǎn)酸急劇下降代謝調(diào)節(jié)氧對檸檬酸積累的調(diào)節(jié)四、檸檬酸發(fā)酵透明圈大的菌株平板：10%甘薯+2%的瓊脂+0.5%CaCO3

誘變后，涂布，透明圈大的則好顯色圈大的菌株

平板：麥汁培養(yǎng)基+pH值指示劑

誘變后，33℃培養(yǎng)3天，透明圈大的則好耐高檸檬酸且不分解檸檬酸的菌株不利用檸檬酸為碳源的