第四章 滅活劑和佐劑 wang

第四章滅活劑和佐劑第一節(jié)滅活劑滅活是生物制品中的一項(xiàng)非?；炯夹g(shù)！??！提高生物制品的安全性防止病原體擴(kuò)散一、滅活與滅活劑（一）什么是滅活？微生物學(xué)意義上滅活有兩層含義：1、是指破壞或殺死微生物使其成為沒有生命物質(zhì)的過程。2、生物制品上的滅活還有滅能的含義，是指將一些活性物質(zhì)（微生物及其代謝產(chǎn)物、激素、酶、血清因子和抗體等）喪失活力的過程。例如：經(jīng)過56度加熱30分鐘處理，可破壞診斷血清和待檢血清中的補(bǔ)體活性，從而避免補(bǔ)體對診斷的干擾作用。生物制品意義上滅活的含義：是利用物理或化學(xué)的方法，破壞微生物的生物學(xué)活性，破壞病原微生物的繁殖能力和致病能力，但仍然保留反應(yīng)原性和免疫原性的過程。（二）滅活的類型按照滅活作用的性質(zhì)可分為兩類：1.物理滅活2.化學(xué)滅活1、物理滅活熱滅活：容易發(fā)生菌體蛋白質(zhì)變性超聲波滅活：應(yīng)放在冰浴中間斷進(jìn)行紫外線滅活：不夠好射線照射滅活：根據(jù)被照射物的容量大小選擇照射距離和照射強(qiáng)度。2、化學(xué)滅活利用化學(xué)藥品等使微生物、活性物質(zhì)的某些某些結(jié)構(gòu)位點(diǎn)發(fā)生改變，從而喪失生命力、感染性、毒性或活性。效能常受滅火劑種類、劑量和作用溫度、pH、時間等因素的影響，使用時必須篩選最佳的滅活條件。方法簡單、效果確實(shí)、最為常用。（三）滅活劑用于滅活微生物的化學(xué)試劑或藥物1911年，LowensteinDH用甲醛處理破傷風(fēng)毒素而制成類毒素1924年，Puntoni以苯酚或甲醛處理制成犬瘟滅活苗1934年，MorionDorset等用結(jié)晶紫滅活豬瘟病毒制成豬瘟結(jié)晶紫疫苗。是最古典、使用最廣泛的滅活劑《獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》（2000）中的26種滅活疫苗，均以甲醛作為滅火劑。二、常用滅活劑的滅活機(jī)理與應(yīng)用1、甲醛甲醛的水溶液——福爾馬林(含甲醛36~40%)

滅活機(jī)理：還原作用

氨基甲基胺

羧基亞甲基二醇單酯

巰基亞甲基二醇

甲醛醛基

羥基羥基甲酚滅活濃度：需氧細(xì)菌0.1％～0.2％，厭氧細(xì)菌0.4％～0.5％，病毒0.05％～0.4％。

滅活原則：低濃度、短時間而又能達(dá)到徹底滅活目的。必要時可在滅活后加入焦亞硫酸鈉，以中斷其反應(yīng)。N-乙酰乙烯亞胺（AEI)、二乙烯亞胺(BEI)、縮水甘油醛（GDA）滅活機(jī)制：

1.烷化DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤等，引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯(lián)，因改變DNA的結(jié)構(gòu)而破壞其功能，妨礙RNA的合成，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂。

2.與酶系統(tǒng)和核蛋白起作用而干擾核酸代謝。2.烷化劑（Alkylatingagent）優(yōu)點(diǎn)：能破壞病毒的核酸芯髓，使病毒完全喪失感染力，而不損害其蛋白衣殼，保留其保護(hù)性抗原。

（1）N-乙酰乙烯亞胺（AEI）淡黃色澄明液體，有輕微氨臭味，能與水或醇任意混合。0～4℃可保存1年，在-20℃可保存2年。AEI功能基團(tuán)是乙烯亞胺基，可用于口蹄疫滅活苗?？谔阋卟《疽?終濃度0.05％，30℃8h,加2％硫代硫酸鈉阻斷（2）二乙烯亞胺（BEI）市購商品為0.2％的BEI溶液，在0～4℃可保存1個月;口蹄疫病毒懸液：終濃度0.02%,加入2％硫代硫酸鈉中斷滅活。大腸桿菌、噬菌體、新城疫病毒滅活效果優(yōu)于甲醛。本品易揮發(fā)，水溶液含量為15～31mg/ml。0～4℃保存3個月后含量漸下降，約半年失效；20℃只能保存10d。

（3）縮水甘油醛（GDA）3.苯酚又稱石碳酸。有腐蝕性，而且有毒！易溶于水及有機(jī)溶劑。滅活機(jī)制：使微生物蛋白質(zhì)變性和抑制如脫氨酶、氧化酶等酶系統(tǒng)的活性，從而導(dǎo)致微生物死亡。通常：生物制品的常用量為0.3%-0.5%,另外，芽孢、真菌和病毒對苯酚的耐受性很強(qiáng)。4.結(jié)晶紫是甲基紫、龍膽紫的純品。滅活機(jī)制：是結(jié)晶紫陽離子與微生物蛋白質(zhì)帶陰性電荷的羧基形成弱電離的化合物，從而干擾微生物正常代謝和氧化還原作用，主要干擾細(xì)胞壁肽聚糖的合成，導(dǎo)致革蘭氏陽性菌生長繁殖受阻。5.β-丙內(nèi)酯又名丙內(nèi)酯。滅活機(jī)制：破壞病毒的核酸芯，但不損壞衣殼蛋白，因此保護(hù)性抗原成分得以保留，主要用于狂犬病滅活苗的制備。然而研究表明，丙內(nèi)酯是一種潛在的致癌因子。6.硫柳汞常用做生物制品的防霉和消毒劑，對霉菌、細(xì)菌和病毒都有一定的滅活作用，百日咳菌苗作為滅火劑。常用濃度為0.01%-0.02%。1、滅活劑特異性：如石炭酸對真菌和病毒效果差，但對細(xì)菌效果好。結(jié)晶紫能殺死多種革蘭氏陽性菌和陰性菌，但對綠膿桿菌和細(xì)胞芽孢作用弱。2、微生物種類和特性：三、影響滅活作用的因素3、滅活劑濃度（一定要適合）4、滅活溫度：通常同一濃度的滅活劑在不同溫度的滅活速度與溫度成正比，但溫度太高，對微生物的抗原性將有不利影響。（具體不同病原體或毒素，其滅活時間和溫度不一致）。5、滅活時間：一般采用低濃度、低溫和短時間處理為最佳。6、滅活pH值：7、微生物含氮量：一般微生物或毒素的總氮量和氨基氮含量越高，滅活劑的消耗量就越大、滅活脫毒越慢。8、有機(jī)物存在：第二節(jié)佐劑佐劑是免疫學(xué)和生物制品學(xué)中的一個重要內(nèi)容對增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答，提高生物制品的免疫效應(yīng)發(fā)揮著重要作用什么是“佐劑”呢？1.佐劑（新概念）：凡是可以增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)均稱為佐劑。

佐劑（舊概念）：當(dāng)一種物質(zhì)先于抗原或與抗原混合或同時注射于動物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答,發(fā)揮其輔佐作用的物質(zhì)。也稱免疫佐劑、抗原佐劑。注意:佐劑和免疫增強(qiáng)劑的關(guān)系?一、佐劑概念與作用特點(diǎn)①明顯增強(qiáng)抗原性微弱的物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。②用最少的抗原和最少的接種次數(shù)，產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答。作用特點(diǎn)：二、研究歷史1、起始階段1916年Moignar最早用羊毛脂與石蠟油制成傷寒沙門氏菌乳劑苗；繼后Prevet用羊毛脂加瓊脂為佐劑制出炭疽菌苗。1925年，GastonRamon證明了明礬的佐劑作用。2、1950年代為提高獸醫(yī)生物制品的免疫效果，在獸醫(yī)領(lǐng)域?qū)ψ魟┻M(jìn)行了廣泛的研究。用氫氧化鋁膠吸附再加油佐劑制成的豬丹毒菌苗，免疫乳豬后的免疫力可持續(xù)9個月，比鋁膠佐劑苗提高1倍。3、1960年代以后礦物油佐劑的研究發(fā)展迅速布氏桿菌油佐劑苗（1966）魏氏梭菌油佐劑苗（1966）流感油乳劑苗（1977））禽支原體+新城疫油乳劑二聯(lián)（1978）鏈球菌+葡萄球菌乳劑二聯(lián)苗（1984）4、我國的佐劑的研究佐劑的研究和佐劑苗的生產(chǎn)，始于1950年代。1958年曾用羊毛脂和液體石蠟油制造豬丹毒油乳劑苗，但效果不理想。1980年代以來，對白油佐劑的研究和應(yīng)用發(fā)展極快，尤以禽病白油佐劑疫苗的種類更多，使用效果也比較滿意。WHO認(rèn)為佐劑除具有免疫增強(qiáng)效應(yīng)外，尚必須具備下列標(biāo)準(zhǔn)，否則不得用作佐劑。三、佐劑標(biāo)準(zhǔn)1、無致癌或輔助致癌性不能誘導(dǎo)或促進(jìn)腫瘤形成。2、安全無毒性通過肌肉、皮下、靜脈、腹腔、滴鼻、口服等各種途徑進(jìn)入動物體后無任何副作用。3、純度高、雜質(zhì)少雜質(zhì)往往是副作用的誘發(fā)物。因此，佐劑必需符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。4、應(yīng)有一定的吸附力最好吸附力強(qiáng)5、在動物體內(nèi)易降解不宜長時期留存而誘發(fā)組織損傷6、不含與動物有交叉的抗原以避免誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，防止發(fā)生自身免疫性疾病。7、不應(yīng)誘發(fā)自身超敏性也不應(yīng)與抗體結(jié)合形成有害的免疫復(fù)合物。8、應(yīng)性質(zhì)穩(wěn)定佐劑抗原混合物儲存1年以上，必須不分解、不變質(zhì)和不產(chǎn)生不良物質(zhì)。四、免疫佐劑作用機(jī)理①改變正常免疫機(jī)能，吸引大量巨噬細(xì)胞以吞噬抗原；②改變抗原的構(gòu)型，使抗原物質(zhì)降解，并加強(qiáng)其免疫原性；③延長抗原在組織內(nèi)的貯存時間，使抗原緩慢降解和緩釋，并發(fā)揮免疫系統(tǒng)的細(xì)胞間協(xié)同作用（巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞，T細(xì)胞與B細(xì)胞）。

作用方式①抗原遞呈（antigenpresentation）②抗原尋的（antigentargeting）③免疫調(diào)節(jié)（immunemodulation）

作用機(jī)理①抗原遞呈：指抗原分子遞呈給T細(xì)胞的方法。佐劑與疫苗聯(lián)合使用，有助于抗原性物質(zhì)在胞內(nèi)被加工，被MHC分子特異性的結(jié)合、保護(hù)、運(yùn)輸并遞呈給效應(yīng)細(xì)胞。②抗原尋的（antigentargeting）指抗原傳遞給免疫系統(tǒng)中適當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞的效率。包括吸引巨噬細(xì)胞到達(dá)組織部位、活化吞噬細(xì)胞、促進(jìn)抗原與細(xì)胞受體的結(jié)合等。③免疫調(diào)節(jié)（immunemodulation）

是指任何可以修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞對抗原或表位進(jìn)行加工的機(jī)制。通過這種機(jī)制，可以改變特異性免疫應(yīng)答的本質(zhì)或強(qiáng)度。T細(xì)胞有Th1和Th2兩個亞類。同一抗原和不同佐劑一起使用能夠引起不同的免疫反應(yīng)。因此，通過篩選特定的佐劑，可以達(dá)到誘導(dǎo)正確的免疫應(yīng)答的目的。1.按佐劑物理性質(zhì)顆粒型佐劑非顆粒型佐劑2.按佐劑的生物學(xué)性質(zhì)（即Ballanti分類法）微生物及其組分佐劑非微生物物質(zhì)佐劑3.按佐劑在體內(nèi)存留的時間貯存型佐劑（depottypeadjuvant）非貯存型佐劑（non-depottypeadjuvant）五、佐劑的分類六、常見的獸用免疫佐劑1、礦物質(zhì)類佐劑礦物質(zhì)佐劑是傳統(tǒng)佐劑中的一類。

在獸用疫苗的制備中廣泛使用。氫氧化鋁膠磷酸鋁膠特點(diǎn)

?主要誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，可刺激機(jī)體迅速產(chǎn)生持久的高抗體水平。?比較安全。缺點(diǎn)

?皮下注射時常有腫脹或結(jié)塊；?不能有效刺激保護(hù)性T細(xì)胞免疫。2、油類佐劑主要有弗氏佐劑弗氏不完全佐劑弗氏完全佐劑白油佐劑是指一類由油類物質(zhì)、水溶液和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。該類佐劑主要在抗原尋的過程中起作用，使抗原在注射部位保持穩(wěn)定，為抗原在淋巴系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)提供載體，增加單核細(xì)胞的形成和積聚。油乳劑疫苗的免疫效力高低，直接與乳化作用的好壞及油、乳化劑質(zhì)量有關(guān)。

油乳佐劑分為單相乳化佐劑雙相乳化佐劑單相乳化佐劑（1）油包水（

W/O）較粘稠，在機(jī)體內(nèi)不易分散；但佐劑活性優(yōu)良，為生物制品所采用的主要劑型（2）水包油（O/W）較稀薄，在機(jī)體內(nèi)易于分散；但佐劑活性很低，生物制品中不采用。雙相乳化佐劑又分為水包油包水和油包水包油型粘度小，注射局部反應(yīng)輕微，易吸收和佐劑效應(yīng)高一種液體或粉末微粒（分散相或內(nèi)相）借助乳化劑、機(jī)械力的作用，分散懸浮于另一種不相溶的液體（連續(xù)相或外相）中從而形成穩(wěn)定的分散體系。油乳佐劑原理乳化劑

指油乳劑中內(nèi)相與外相間的界面活性物質(zhì)，具有促進(jìn)和穩(wěn)定兩種互不相溶物形成乳劑。如羊毛脂、Span-80、Arlacel-80、Tween-80、AtlsG-1471等。乳化原理降低分散物的表面張力，在微滴表面上形成薄膜或雙片層，以阻止微滴(粒)的相互凝結(jié)。佛氏不完全佐劑

是由低引力和低粘度的礦物油及乳化劑組成的一種貯藏性佐劑。佛氏完全佐劑在不完全佐劑的基礎(chǔ)上加一定量的分支桿菌而成。雖然具有一定的副作用，但其佐劑活性是其它物質(zhì)難于相比的。佛氏佐劑的特點(diǎn)可使在正常狀態(tài)下缺乏免疫原性的物質(zhì)成為免疫原。先作用于Th1細(xì)胞，后是Th2細(xì)胞，并能啟動細(xì)胞免疫而發(fā)揮作用。國外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4國內(nèi)常用白油：7號或10號白油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):

無色無味；

50℃運(yùn)動粘度7m2／s左右；紫外吸收值（250-350）＜0.1％，紫外消光系數(shù)＜12×108；單環(huán)芳烴與雙環(huán)芳烴含量低于0.5％，無多環(huán)芳烴；小鼠腹腔注射0.5ml觀察160d或家免皮下注射2.0ml白油觀察60d，表現(xiàn)正常。白油佐劑（1）劑在水中法：將乳化劑直接溶于水中，在激烈攪拌下將油加入，可直接生成O/W乳劑。若欲得W/O型，可繼續(xù)加入油，直到發(fā)生變型。該法通常用勻漿器或膠體磨，高速攪拌而得到較好的乳劑。油乳佐劑乳化方法（2）劑在油中法：將乳化劑溶于油相，將油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，繼續(xù)加入至變型。該法制成的乳劑，一般均勻顆粒直徑在0.5μm左右，比較穩(wěn)定。免疫實(shí)驗(yàn)動物用的佐劑配制:

(1)弗氏佐劑：礦物油75%~85％，乳化劑15％~25%，混合后經(jīng)除菌過濾而成為FIA；如向其中加入0.5mg／m1死結(jié)核桿菌即為FCA。使用時，將含抗原的水相，與上述任一佐劑等量混合，用力振搖即可成為均勻的乳劑。(2)白油佐劑