第三講 病毒的遺傳變異

病毒的一步生長(zhǎng)曲線（one-stepgrowthcurve）

感染比（multiplicityofinfection,MOI）是指在一個(gè)系統(tǒng)中感染病毒的細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比。在人工培養(yǎng)的細(xì)胞中，接種高M(jìn)OI的病毒，使所有細(xì)胞幾乎同時(shí)受到病毒感染，如分析該培養(yǎng)系統(tǒng)中的單個(gè)細(xì)胞，就可以代表病毒在整個(gè)體系中所有細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。應(yīng)用這一方法，可獲得病毒一步生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)的結(jié)果（圖22-1），觀察到病毒具有復(fù)制周期（replicationcycle）。一個(gè)完整的復(fù)制周期包括吸附、穿入與脫殼、生物合成、組裝與釋放等步驟。病毒感染細(xì)胞之后的一個(gè)短時(shí)間內(nèi)，病毒完全消失，甚至在細(xì)胞內(nèi)也找不到傳染性的病毒顆粒，直至感染數(shù)小時(shí)后子代病毒出現(xiàn)為止，這階段稱為隱蔽期（eclipseperiod），一般持續(xù)2~12h。

在病毒的遺傳與變異Whatisagene?StablesourceofinformationAbilitytoreplicateaccuratelyCapableofchange基因激活轉(zhuǎn)錄起始翻譯后加工翻譯RNADNAPr轉(zhuǎn)錄后加工mRNA降解細(xì)菌

外源性的遺傳物質(zhì)由供體菌進(jìn)入受體菌細(xì)胞內(nèi)的過程稱為基因轉(zhuǎn)移（genetransfer)；轉(zhuǎn)移的基因與受體菌DNA整合在一起稱為重組(recombination)。細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移和重組的主要方式有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合。FrederickGriffith’sTransformationExperiment-1928“transformingprinciple”demonstratedwithStreptococcuspneumoniae病毒第一節(jié)突變第二節(jié)誘變第三節(jié)基因重組第四節(jié)病毒基因產(chǎn)物間的相互作用準(zhǔn)種：由一種母序列和來自該序列的大量突變基因組所組成的病毒群體。表型的一致性，遺傳的動(dòng)態(tài)差異，在變異中保持穩(wěn)定。突變

病毒復(fù)制過程中單個(gè)或者成段的核苷酸序列發(fā)生替換、缺失、插入等現(xiàn)象。缺損型干擾（defectiveinterfering，DI）突變株，突變的特例缺損型干擾(defectiveinterfering,DI)突變株

這是一種缺失突變的產(chǎn)物。自身不能復(fù)制,只有在親本野生株作為輔助病毒存在時(shí)才能復(fù)制,但又干擾親本病毒的復(fù)制,導(dǎo)致后者數(shù)量減少。含正常的衣殼蛋白質(zhì)只含有正常基因組的一部分只能在正常同源病毒同時(shí)存在時(shí)才能繁殖,這時(shí)同源病毒成為輔助病毒(helpervirus)特異性地干擾同源病毒的繁殖,經(jīng)連續(xù)傳代后,DI顆粒增多突變率和適應(yīng)性迅速?gòu)?fù)制的能力較高的胞內(nèi)滴度特定細(xì)胞受體的選擇慢性感染以及隱性感染逃避防御機(jī)制傳播方式的適應(yīng)誘變病毒復(fù)制時(shí)前者可摻入RNA病毒的核酸，后者可摻入DNA病毒的核酸。定點(diǎn)誘變，在預(yù)定的序列位置上插入核苷酸。1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。

2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。

3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。

4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。

5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì).

基因重組分子內(nèi)重組重配

將兩個(gè)有親緣關(guān)系但生物學(xué)性狀不同的毒株感染同一個(gè)宿主細(xì)胞，從而可發(fā)生核酸水平上的互換，產(chǎn)生兼有兩親本特性的子代，稱為重組。一、分子內(nèi)重組分子內(nèi)重組：兩種密切的相關(guān)但序列不同的病毒核苷酸

病毒與病毒病毒與細(xì)胞Recombinationbybreak-rejoinofincompletelylinkedgenes

重配大多數(shù)情況下特指基因組分節(jié)段的RNA病毒，砂粒病毒雙RNA病毒布尼病毒正黏病毒以及呼腸孤病毒。兩個(gè)進(jìn)化相近的毒株感染同一細(xì)胞是，兩者發(fā)生了基因的交換，產(chǎn)生穩(wěn)定或可變的重配毒株。二、重配(reassortment)

Reassortmentbyindependentassortmentduringdualinfection病毒進(jìn)化的例證粘液瘤病毒與宿主的共同進(jìn)化甲型流感病毒的抗原性轉(zhuǎn)移以及漂移重組的甲型流感在人群中三次大流行：1918年西班牙流感

1957年亞洲流感1968年香港流感

人類的感染流感期間CampFunston的緊急軍事醫(yī)院。禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV）1901年即分離禽流感病毒，但直到1955年才明確它與人及哺乳動(dòng)物流感的關(guān)系，20世紀(jì)70年代開始注意在水禽廣泛存在的禽流感病毒是流感病毒的“基因庫(kù)”，并對(duì)家禽業(yè)構(gòu)成潛在威脅。禽流感的高致病力毒株對(duì)雞有致病性，舊稱“真性雞瘟”（fowlplague），現(xiàn)名高致病性禽流感（Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI）是OIE規(guī)定的通報(bào)疫病。病毒毒力有很大差異。高致病力毒株主要有H5N1和H7N7亞型的某些毒株。禽流感病毒能感染人，某些毒株甚至可不經(jīng)過豬體混合重配再傳染的過程，直接感染人。國(guó)外學(xué)者認(rèn)為，在中國(guó)南部生活著密集的人群及養(yǎng)殖大量的豬和鴨，彼此密切接觸提供了上述的機(jī)遇。其實(shí)除華南之外，東南亞也具有類似情況，2004年禽流感在該地區(qū)的廣泛流行，似可為佐證。野生水禽是禽流感病毒的基因庫(kù)病毒的變異甲型流感病毒變異的顯著特點(diǎn)是HA和NA發(fā)生遺傳性或抗原性漂移（geneticorantigenicdrift）遺傳性或抗原性轉(zhuǎn)移（geneticorantigenicshift）抗原性變異是HA和NA二者的遺傳性或抗原性漂移（geneticorantigenicdrift）及遺傳性或抗原性轉(zhuǎn)移（geneticorantigenicshift）導(dǎo)致的。漂移發(fā)生在某個(gè)亞型之內(nèi)，是點(diǎn)突變的積蓄，其中和表位與未突變株稍有差異。轉(zhuǎn)移則驟然獲得一個(gè)全新的HA或NA基因，從而產(chǎn)生新的亞型，可能在全世界引致新型流感的暴發(fā)流行。

隨機(jī)突變基因組節(jié)段交換流感病毒抗原性漂移及轉(zhuǎn)移示意（據(jù)Harper）漂移轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移源于禽類的甲型流感病毒在人體很難增殖，反之亦然二者均能在豬體內(nèi)增殖，并在豬體內(nèi)進(jìn)行基因重配，豬體是人流感毒株與禽流感毒株的混合器，在豬體內(nèi)流感病毒產(chǎn)生抗原性轉(zhuǎn)移甲型流感病毒傳播的

經(jīng)典模式毒力變異的分子基礎(chǔ)HA是否富含堿性氨基酸。HA裂解為HA1和HA2，暴露融合肽段，通過融合進(jìn)入宿主細(xì)胞。高致病力毒株與低致病力毒株的H裂解位點(diǎn)的氨基酸序列有差異，前者為-X-X-精氨酸-X-精氨酸/賴氨酸-精氨酸-（X為非堿性氨基酸），而低毒株僅有單個(gè)精氨酸，蛋白酶切割率極低，不易裂解。NA26個(gè)氨基酸的缺失及PB2蛋白氨基酸的突變也影響病毒的毒力。毒力變異的分子基礎(chǔ)HA是否富含堿性氨基酸。HA裂解為HA1和HA2，暴露融合肽段，通過融合進(jìn)入宿主細(xì)胞，為入侵的關(guān)鍵步驟。高致病力毒株HA的切割位點(diǎn)有多個(gè)氨基端毗連，決定該病毒可被機(jī)體大多數(shù)組織細(xì)胞的蛋白酶裂解。低致病力的裂解位點(diǎn)均只有一個(gè)單一的堿性氨基酸—精氨酸，只能被胰蛋白酶切割，存在于消化道和呼吸道。球體表面糖基化位點(diǎn)（影響細(xì)胞親和性），多聚酶復(fù)合體的作用（H5N1,NS1變化，破壞細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通道）等。蛋白酶

催化蛋白質(zhì)水解的酶類。種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。蛋白酶對(duì)所作用的反應(yīng)底物有嚴(yán)格的選擇性，一種蛋白酶僅能作用于蛋白質(zhì)分子中一定的肽鍵，如胰蛋白酶催化水解堿性氨基酸所形成的肽鍵1983年4月在美國(guó)賓州發(fā)現(xiàn)低毒力的禽流感H5N2，致死率低于10%，它與當(dāng)時(shí)美國(guó)東部從野鳥分離的H5N2基因很相似同年10月，H5N2毒株的致死率突然上升至80%。將4月及10月的兩毒株比較，發(fā)現(xiàn)毒力的變異是因點(diǎn)突變所致，亦即發(fā)生抗原性漂移表現(xiàn)為H基因的7個(gè)核苷酸二者有差異，從而導(dǎo)致H蛋白的4個(gè)氨基酸改變，有利H0的裂解及活化，致使毒力增強(qiáng)HA和NA兩個(gè)基因上的變異可以隨時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)生積累，但是流感病毒其他基因的變異在短期內(nèi)似乎并不隨時(shí)間的延長(zhǎng)