血凝抑制實驗在雞病診斷中的應用

血凝抑制實驗在雞病診斷中的應用

1海相基因成分和血凝抑制實驗一些鳥類疾病，如新城病毒、流感病毒、傳染性支氣管炎病毒（經(jīng)濃縮和酶處理后）、127株腺體疾病患者和一些支流正在儲存紅細胞（血凝素-神經(jīng)酸酶hn蛋白與紅細胞表面受體結合）。這種紅細胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制,即血凝抑制實驗(HI)。用該實驗可檢測雞體注苗后抗體應答水平及證實是否曾受感染。HI實驗的基本成分是血凝(HA)抗原,系列稀釋的血清和紅細胞懸液(0.5%～1.0%)。實驗可在小試管或微量板(96孔V型板)中進行。生產(chǎn)中一般多用固定抗原稀釋血清法(β-法),而很少用固定血清稀釋抗原法(α-法)。HA抗原可從供應商處購得(如哈獸研,中監(jiān)所),也可自制。HI實驗每孔使用血凝單位因抗原不同而各異:新城疫(ND)用8～10個或4個HA單位,流感(AI)用4個或2個HA單位,支原體用2～4個HA單位,腺病毒(EDS-76)用8～10個HA單位(美國禽病學家協(xié)會推薦),生產(chǎn)中常用4個HA單位,實驗時應先測定抗原HA單位,再稀釋至所需工作用HA單位。HI實驗中,HA抗原濃度會影響最終實驗結果,但HA單位較細小的差別對被檢血清HI效價影響不大。一般情況下,增加HA抗原濃度會降低HI反應敏感性,而減少HA抗原濃度可提高敏感性。即工作抗原效價過高測定抗體效價偏低,工作抗原效價過低,測定抗體效價偏高。血凝實驗、血凝抑制實驗應用于病毒的分離、鑒定、分型;測定抗體、抗原及免疫鑒定。2離心前后的血清用于分離血清的血液必須是新鮮無污染。將血液放入硅化管或一次性塑料離心管內(nèi),水平放置于37℃環(huán)境下數(shù)小時,再用離心機8000～10000r/min離心3～5min,將析出的血清移入清潔的包裝內(nèi)備用。3胞懸液濃度對抗體效價的影響若供體雞是經(jīng)檢驗符合要求的,可從單只雞體采集紅細胞,否則建議用3只以上雞的血液混合制備紅細胞懸液。有抗體雞提供的紅細胞需要更多次的洗滌(5遍以上),但應注意有時不同的雞提供的紅細胞懸液對禽流感H5亞型的抗體測定效價差異很大,并且紅細胞懸液濃度對抗體效價也有影響,一般取0.5%～1.0%,大于1%時血凝價會降低,血凝抑制價會偏高;小于0.5%時血凝價偏高,血凝抑制價偏低。采血時先將注射器內(nèi)吸入3.8%～4.0%枸櫞酸鈉(1份抗凝液可抗凝4份血液)或阿氏液(抗凝劑和血液等體積)再采血。采完后將抗凝劑和血液輕輕搖勻,再注入大離心管內(nèi)加生理鹽水洗滌,洗滌按2500～3000r/min離心3～5次,每次離心后棄掉上清液和白細胞層,保留紅細胞層。洗滌完畢,用生理鹽水稀釋成0.5%～1.0%紅細胞懸液。配好的紅細胞懸液要做血球沉淀檢查:取96孔V型板一塊,滴1滴紅細胞懸液到任意孔內(nèi),室溫靜置20～40min,查看血球沉淀情況,決定是否能用。如血球沉淀檢查合格,則該批紅細胞懸液應在24h內(nèi)用完,如過夜應再離心洗滌1～2次。4血液抑制和血液抑制的具體操作過程h-法4.1ha體驗(1)96個v型板，25μL/孔加生理鹽水。(2)孔1μL抗原。(3)將倍比稀釋至11個孔，稀釋25個孔μL,第12孔作對照。(4)每個孔加入25克生理鹽水μL。(注)(5)每個孔加入25克紅細胞懸液μL。(6)振動室，20.40min。(7)記錄結果(注):該方法中第二次加生理鹽水是為讓HA實驗與HI實驗每孔中液體量相等,以保持抗原濃度相等。4.2紅細胞懸液的制備(1)依據(jù)抗原類型及HA實驗結果配制工作抗原。(2)于96孔V型板中按加25μL/孔生理鹽水到1～12孔。(3)第一孔加25μL待檢血清。(4)倍比稀釋至第10孔,棄掉25μL。(5)加工作抗原25μL/孔至第1～11孔。(6)振蕩1min室溫靜置20min。(7)于96孔V型板內(nèi)按每孔加25μL紅細胞懸液。(8)振蕩1min室溫靜置20～40min。(9)記錄結果。4.3影響ha和hi測試結果的因素(1)試驗所需的設備應清潔特別是96孔V型板,內(nèi)壁不僅要求干凈,還要求光滑無劃痕、破損。(2)紅細胞懸液質(zhì)量見上述“紅細胞懸液”。(3)抵抗抗原不能反復凍融,每批抗原每次使用前都要用陽性、陰性血清檢測一次。其它注意事項見上述“HA抗原”。(4)紅細胞吸附法A.56℃30min滅活:所有待檢血清放在56℃水浴鍋中作用30min。B.紅細胞吸附:取20%～50%紅血球加入待檢血清37℃作用30min離心,取上清液為待檢血清。C.用化學試劑:10%～50%高嶺土放入待檢血清,作用一段時間,離心取上清液。(5)抗原劑和抗原劑的反應時間很長時間過短出現(xiàn)凝集不完全,時間過長出現(xiàn)洗脫現(xiàn)象。(6)對照孔凝集物的測定A.HA試驗:以紅細胞對照完全沉淀為標準,一般在室溫條件下20～45min出結果。B.HI試驗:抗原對照孔出現(xiàn)完全凝集,生理鹽水對照孔出現(xiàn)完全沉淀為標準。一般在室溫條件下20～45min出結果。(7)正確的溫度一般室溫條件下溫度偏高出結果快一點,偏低出結果慢一點,但當試驗溫度低于4℃時,紅細胞會出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。(8)權插液液配制A.倍比稀釋次數(shù),一般取8～16次。B.稀釋時,滴頭不能垂直插在孔底,應稍斜一下;滴頭不能離開液面,以免產(chǎn)生氣泡;最后一次稀釋時應將滴頭內(nèi)的液體完全排空(移液器第二檔),再吸取液體移至下一孔。C.加樣:除第一次加生理鹽水并稀釋完抗原(抗體)后,再加其它液體時應先加對照孔,再從低濃度向高濃度加;加樣時滴頭可貼在孔壁上緣,但不能接觸液面;加紅細胞懸液時應邊加邊搖晃盛紅細胞懸液的容器。4.4hi測試中的錯誤(1)鹽水的細菌凈化A.鹽類凝集:稀釋液中NaCl達到一定濃度時,即使沒有血清抗體也能發(fā)生凝集。B.當生理鹽水被細菌污染時,也可能出現(xiàn)對照孔凝集。C