細菌趨化反應中蛋白質生物力學的研究進展

細菌趨化反應中蛋白質生物力學的研究進展

細菌的趨勢是具有運動能力的細菌對環(huán)境中的刺激物做出附近吸引和遠離排斥的行為。Engelmann于1881年及Preffer于1883年最早報道細菌趨化性。隨后的幾十年細菌趨化性研究并未取得較大進展。直到1960年,Alder深入研究了細菌趨化性的分子機制,提出大腸桿菌(Escherichiacoli)對氨基酸以及糖的趨化性是由位于細胞表面的受體蛋白調(diào)節(jié)的,并由細胞內(nèi)分子傳遞信號最終影響細菌的行為。此后,越來越多的研究人員開始從事細菌趨化性的研究,并取得了許多重要結果。1高速旋轉推動細胞做直線運動以大腸桿菌為例,每個細胞有4-10根鞭毛,鞭毛的快速旋轉使得細菌具有運動能力。鞭毛的旋轉有兩種形式:一種是逆時針旋轉(counter-clockwise,CCW),此時鞭毛擰成一股形成一個“束”,束高速旋轉推動細胞做直線運動,即細菌的泳動行為(swim);另一種是順時針旋轉(clockwise,CW),束分散或松開導致細胞原地翻滾(tumble),當鞭毛束重新形成,細胞已改變了運動方向開始下一個泳動。細菌依據(jù)一種記憶機制來感應環(huán)境中的化學濃度梯度,通過對比現(xiàn)有的濃度和過去的濃度來調(diào)整運動行為。細菌在沒有化學濃度梯度的環(huán)境中,其運動方向是隨機的,一般是向前直線運動幾秒鐘就停下來翻滾,然后再以不同的方向進行直線運動,如此循環(huán)往復。當細菌感知到周圍的誘導劑濃度降低或驅避劑濃度增加時,翻滾的頻率就會增加,從而使細菌遠離不利的環(huán)境。反之,翻滾的頻率會下降,細菌保持直線運動靠近對它有利的環(huán)境。2鞭毛旋轉時細胞的趨化性細菌本身太小,并不能感知空間中存在的化學濃度梯度,但是卻能對隨時改變的化學濃度梯度反應十分敏感,這是因為它們能利用受體蛋白感知細胞外面的刺激物信號,從而調(diào)節(jié)鞭毛旋轉的方向。在大腸桿菌中,趨化性是通過兩個大分子復合體(supramolecularcomplexes)調(diào)節(jié)的,即位于細胞兩級的受體復合體(receptorcomplexs)和隨機分布于細胞四周、埋于細胞膜中的鞭毛-馬達復合體(flagellar-motorcomplex,一般每個細胞有5-10個)。一個信使蛋白——趨化反應調(diào)節(jié)蛋白(chemotaxisresponseregulator,CheY)來回穿梭于兩個復合體之間進行從受體到鞭毛的信號傳遞。2.1體外細胞周質感受區(qū)aer跨膜的受體復合體由甲基趨化性受體(methyl-acceptingchemotaxisproteins,MCP),組氨酸激酶CheA和連接蛋白CheW組成。大腸桿菌的受體有5種:Tar、Tsr、Trg、Tap和Aer。不同受體感知不同刺激物的信號,如Tar調(diào)節(jié)對天冬氨酸、谷氨酸和麥芽糖的反應;Tsr調(diào)節(jié)對絲氨酸的反應;Trg調(diào)節(jié)對核糖和半乳糖的反應;Tap調(diào)節(jié)多肽的反應;Aer調(diào)節(jié)對氧的反應。這些受體以同源二聚體形式存在,都由一個高度可變的負責與刺激物結合的細胞周質感受區(qū)和一個保守的提供與CheA和CheW結合平臺的細胞質信號區(qū)構成。保守的細胞質信號區(qū)又可以分為3個亞結構域:(1)HAMP結構域,負責連接跨膜螺旋與胞質的信號區(qū)域;(2)甲基化的螺旋區(qū)域,包含4個或更多的谷氨?；?可被甲基轉移酶(methyltransferase)CheR進行甲基化修飾,被甲基酯酶(methylesterase)CheB去甲基化;(3)信號區(qū)域,CheA和CheW與受體在此區(qū)域結合。大腸桿菌的受體數(shù)目相對于其他微生物是比較少的,如新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)的受體有18種,霍亂弧菌(Vibriocholerae)受體至少有46種。CheW作為一種連接蛋白,可與MCP和CheA結合,形成MCP-CheW-CheA復合體。CheA蛋白屬于“二元調(diào)控系統(tǒng)”中的傳感激酶,可發(fā)生磷酸化,并可在有ATP存在的情況下將磷酸基團轉移到CheY上,使CheY發(fā)生磷酸化。CheA既可以與CheW結合,也可直接與MCP結合。當MCP未與吸引劑結合時,CheA自身磷酸化并將信號傳導至CheY;當吸引劑結合到MCP上時,導致受體構象發(fā)生變化,CheA的自身磷酸化受到抑制,影響了CheY的磷酸化。2.2tator組成結構鞭毛-馬達是一個把跨膜離子梯度貯存的電化學勢能轉化為旋轉運動機械能的裝置,位于鞭毛的基底部,由轉子(rotor)和定子(stator)組成。MotA和MotB是跨膜蛋白,二者共同組成質子通道,MotA/MotB復合體構成馬達中的非旋轉部分,即定子。而FliG、FliM和FliN在鞭毛基底部形成一個功能復合體,稱為切換復合體(switchingcomplex),構成了馬達的轉子,它可以決定鞭毛的旋轉方向。在復合體內(nèi),這些切換蛋白可以相互作用,而且FliG可與MotA結合從而連接轉子和定子。2.3chey的磷酸化刺激信號由受體復合體到鞭毛-馬達復合體的傳遞需要由CheY調(diào)節(jié)完成。CheY屬于“二元調(diào)控系統(tǒng)”中的調(diào)節(jié)蛋白,大小為14kD,具有多重功能。一旦CheA自身磷酸化,它就能快速地將磷酸基團轉移到CheY的Asp57。CheY的磷酸化導致構象的變化,減少了CheY對CheA的親和力,提高了與FliM蛋白(鞭毛-馬達復合體的一個組成部分)的親和力。結果,當磷酸化的CheY(CheY-P)從受體復合體上釋放出來之后,它在細胞質內(nèi)迅速擴散,并通過FliM與鞭毛-馬達復合體相互作用。這種依靠磷酸化的相互作用的最終結果是鞭毛CW旋轉的可能性增加了,細菌開始做一種翻筋斗式的運動。2.4chy蛋白活性的調(diào)節(jié)細菌趨化性反應調(diào)節(jié)機制的關鍵就在于CheY蛋白的活性調(diào)節(jié),它的磷酸化和乙酰化狀態(tài)都能直接影響CheY與其他蛋白的結合能力,從而調(diào)節(jié)細菌鞭毛的旋轉方向,進而決定細菌的運動方式。2.4.1chy磷酸化的結構目前,來源于多種微生物中的CheY結構都被解析清楚,以大腸桿菌為例,CheY擁有典型的反應調(diào)節(jié)子結構,有1個結構域,由5個α-螺旋和5個β-折疊構成。分別位于β1、β3和β5羧基端的Asp13、Asp57和Lys109構成了CheY的活性中心。其中,Asp13對于Mg2+的結合是必需的,Lys109通過它的ε-氨基與Asp57的羧基形成氫鍵。而既然Asp57是CheY的磷酸化位點,那么當CheY磷酸化后Lys109和Asp57的相對位置就有可能發(fā)生改變,以容納Asp57上連接的磷酸基團。事實上,Lys鏈柔韌性很好,因此,Asp57的磷酸化就有可能造成活性中心的重排及Lys109構象的變化。2001年,Lee等用BeF3-CheY的結構模擬了磷酸化的CheY結構,與P-CheY類似,BeF3-CheY與FliM和CheZ的親和力增強,而與CheA的親和力降低。對比CheY的活性狀態(tài)與非活性狀態(tài)的蛋白結構發(fā)現(xiàn),激活后的CheY結構只有少量改變。這些變化主要集中在β4/H4轉角,此區(qū)域在非活性狀態(tài)的CheY中是較柔韌的,并且是與FliM結合的區(qū)域的一部分。2.4.2shey功能的調(diào)整CheY蛋白可以發(fā)生兩種化學修飾:磷酸化和乙?；?。因此,它就有兩種不同的活性調(diào)節(jié)方式。2.4.2.chys磷酸化的去除cyCheY可在Asp57位發(fā)生磷酸化,由CheA或一些小分子如乙酰磷酸提供磷酸化基團。盡管乙酰磷酸在細胞內(nèi)普遍存在,而且其水平隨著生長階段和條件而改變。事實上,乙酰磷酸調(diào)節(jié)的CheY磷酸化的速度要遠低于CheA調(diào)節(jié)的磷酸化。因此,在體內(nèi)乙酰磷酸對CheY的磷酸化貢獻可能較小,但在體外卻是一種較為有效的CheY磷酸化方式。一直以來,人們都認為磷酸化的CheY(CheY-P)與FliM的結合力增強,從而使鞭毛CW的頻率增加,細菌呈現(xiàn)翻滾行為。但是,Sarkar等于2010年研究發(fā)現(xiàn),CheY-P還能與FliN蛋白結合,進一步也能使細菌鞭毛CW的頻率增加。另外,CheY-P還可發(fā)生去磷酸化,去磷酸化酶CheZ可以加速它的去磷酸化過程,從而降低它與FliM的結合,最后終止鞭毛的CW。研究表明,CheZ的C端負責與CheY結合。而一旦CheY-P與FliM結合,CheZ就不能催化它的去磷酸化,因為它只能催化尚未結合的CheY-P的去磷酸化。2.4.2.chys的乙?；?004年,Barak等首次用純化的E.coli的乙酰輔酶A合成酶(Acs)證實它在體外可將CheY乙?；?。另外,通過質譜分析,CheY的6個Lys乙?；稽c被鑒定出來,分別是:Lys91、92、109、119、122和126。這些乙?；稽c都集中在CheY的C端,正好是CheY與CheA,CheZ和FliM結合的區(qū)域。隨后,Barak等于2006年報道CheY可以利用AcCoA作為乙?；鶃碓炊l(fā)生自乙?；?。另外,有研究人員還提出在細菌體內(nèi)存在一種未知的乙酰轉移酶也可以催化CheY的乙酰化。CheY的去乙?；袃煞N方式,一種是由Acs負責催化的去乙酰化,另外一種是由沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silenceinformationregulator2,Sir2)在細菌中的同源蛋白CobB催化的依賴于NAD+的去乙?；^程。而且,細菌體內(nèi)的試驗證明后一種方式起主要作用。2008年Yan等在細菌體內(nèi)能直接測到CheY的乙酰化。2010年,Li等發(fā)現(xiàn)cobB敲除株CheY乙?；矫黠@增高,但對刺激物的趨化反應能力下降。同時,他們還證明乙?；档土薈heY與FliM之間的親和力。而Liarzi等也發(fā)現(xiàn)CheY的乙?；瘯绊懰cCheA、CheZ和FliM的結合。由此可見,CheY的乙?；_實能影響細菌的趨化性。但由于其乙酰化速度較慢,因此人們認為,與磷酸化這種快速的調(diào)節(jié)方式相比,乙?；且环N較慢的調(diào)節(jié)細菌趨化性的方式。2.4.2.chey的磷酸化和乙?；?004年,Barak和Eisenbach在體外研究發(fā)現(xiàn),CheY的磷酸化與乙?；@兩種修飾并非孤立進行,而是可以相互影響。如CheY的磷酸基來源——CheA及乙酰磷酸可以強烈抑制CheY的乙酰化,而CheZ則與之相反,可以增強CheY的乙?；?。另外,Acs可以提高CheA和CheY的磷酸化水平。2010年,Li等通過構建cheA和cheZ的敲除菌株在細菌體內(nèi)證實CheY的磷酸化與乙?；_實相互影響、相互調(diào)節(jié)的。但兩者相互調(diào)節(jié)的具體機制還有待進一步深入研究。3chy的乙?；盘柺荏w受體抗體研究細菌趨化性對于利用細菌治理環(huán)境、控制病原菌侵染機體,以及開發(fā)微生物工業(yè)項目等方面都具有重要意義。隨著人們對細菌趨化性信號傳導及調(diào)節(jié)機制研究的不斷深入,新問題也不斷出現(xiàn)。第一,除了已知的向CheY傳遞磷酸化的信號受體復合體之外,是否還存在