細(xì)菌趨化反應(yīng)中蛋白質(zhì)生物力學(xué)的研究進展

細(xì)菌趨化反應(yīng)中蛋白質(zhì)生物力學(xué)的研究進展

細(xì)菌的趨勢是具有運動能力的細(xì)菌對環(huán)境中的刺激物做出附近吸引和遠離排斥的行為。Engelmann于1881年及Preffer于1883年最早報道細(xì)菌趨化性。隨后的幾十年細(xì)菌趨化性研究并未取得較大進展。直到1960年,Alder深入研究了細(xì)菌趨化性的分子機制,提出大腸桿菌(Escherichiacoli)對氨基酸以及糖的趨化性是由位于細(xì)胞表面的受體蛋白調(diào)節(jié)的,并由細(xì)胞內(nèi)分子傳遞信號最終影響細(xì)菌的行為。此后,越來越多的研究人員開始從事細(xì)菌趨化性的研究,并取得了許多重要結(jié)果。1高速旋轉(zhuǎn)推動細(xì)胞做直線運動以大腸桿菌為例,每個細(xì)胞有4-10根鞭毛,鞭毛的快速旋轉(zhuǎn)使得細(xì)菌具有運動能力。鞭毛的旋轉(zhuǎn)有兩種形式:一種是逆時針旋轉(zhuǎn)(counter-clockwise,CCW),此時鞭毛擰成一股形成一個“束”,束高速旋轉(zhuǎn)推動細(xì)胞做直線運動,即細(xì)菌的泳動行為(swim);另一種是順時針旋轉(zhuǎn)(clockwise,CW),束分散或松開導(dǎo)致細(xì)胞原地翻滾(tumble),當(dāng)鞭毛束重新形成,細(xì)胞已改變了運動方向開始下一個泳動。細(xì)菌依據(jù)一種記憶機制來感應(yīng)環(huán)境中的化學(xué)濃度梯度,通過對比現(xiàn)有的濃度和過去的濃度來調(diào)整運動行為。細(xì)菌在沒有化學(xué)濃度梯度的環(huán)境中,其運動方向是隨機的,一般是向前直線運動幾秒鐘就停下來翻滾,然后再以不同的方向進行直線運動,如此循環(huán)往復(fù)。當(dāng)細(xì)菌感知到周圍的誘導(dǎo)劑濃度降低或驅(qū)避劑濃度增加時,翻滾的頻率就會增加,從而使細(xì)菌遠離不利的環(huán)境。反之,翻滾的頻率會下降,細(xì)菌保持直線運動靠近對它有利的環(huán)境。2鞭毛旋轉(zhuǎn)時細(xì)胞的趨化性細(xì)菌本身太小,并不能感知空間中存在的化學(xué)濃度梯度,但是卻能對隨時改變的化學(xué)濃度梯度反應(yīng)十分敏感,這是因為它們能利用受體蛋白感知細(xì)胞外面的刺激物信號,從而調(diào)節(jié)鞭毛旋轉(zhuǎn)的方向。在大腸桿菌中,趨化性是通過兩個大分子復(fù)合體(supramolecularcomplexes)調(diào)節(jié)的,即位于細(xì)胞兩級的受體復(fù)合體(receptorcomplexs)和隨機分布于細(xì)胞四周、埋于細(xì)胞膜中的鞭毛-馬達復(fù)合體(flagellar-motorcomplex,一般每個細(xì)胞有5-10個)。一個信使蛋白——趨化反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(chemotaxisresponseregulator,CheY)來回穿梭于兩個復(fù)合體之間進行從受體到鞭毛的信號傳遞。2.1體外細(xì)胞周質(zhì)感受區(qū)aer跨膜的受體復(fù)合體由甲基趨化性受體(methyl-acceptingchemotaxisproteins,MCP),組氨酸激酶CheA和連接蛋白CheW組成。大腸桿菌的受體有5種:Tar、Tsr、Trg、Tap和Aer。不同受體感知不同刺激物的信號,如Tar調(diào)節(jié)對天冬氨酸、谷氨酸和麥芽糖的反應(yīng);Tsr調(diào)節(jié)對絲氨酸的反應(yīng);Trg調(diào)節(jié)對核糖和半乳糖的反應(yīng);Tap調(diào)節(jié)多肽的反應(yīng);Aer調(diào)節(jié)對氧的反應(yīng)。這些受體以同源二聚體形式存在,都由一個高度可變的負(fù)責(zé)與刺激物結(jié)合的細(xì)胞周質(zhì)感受區(qū)和一個保守的提供與CheA和CheW結(jié)合平臺的細(xì)胞質(zhì)信號區(qū)構(gòu)成。保守的細(xì)胞質(zhì)信號區(qū)又可以分為3個亞結(jié)構(gòu)域:(1)HAMP結(jié)構(gòu)域,負(fù)責(zé)連接跨膜螺旋與胞質(zhì)的信號區(qū)域;(2)甲基化的螺旋區(qū)域,包含4個或更多的谷氨?；?可被甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase)CheR進行甲基化修飾,被甲基酯酶(methylesterase)CheB去甲基化;(3)信號區(qū)域,CheA和CheW與受體在此區(qū)域結(jié)合。大腸桿菌的受體數(shù)目相對于其他微生物是比較少的,如新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)的受體有18種,霍亂弧菌(Vibriocholerae)受體至少有46種。CheW作為一種連接蛋白,可與MCP和CheA結(jié)合,形成MCP-CheW-CheA復(fù)合體。CheA蛋白屬于“二元調(diào)控系統(tǒng)”中的傳感激酶,可發(fā)生磷酸化,并可在有ATP存在的情況下將磷酸基團轉(zhuǎn)移到CheY上,使CheY發(fā)生磷酸化。CheA既可以與CheW結(jié)合,也可直接與MCP結(jié)合。當(dāng)MCP未與吸引劑結(jié)合時,CheA自身磷酸化并將信號傳導(dǎo)至CheY;當(dāng)吸引劑結(jié)合到MCP上時,導(dǎo)致受體構(gòu)象發(fā)生變化,CheA的自身磷酸化受到抑制,影響了CheY的磷酸化。2.2tator組成結(jié)構(gòu)鞭毛-馬達是一個把跨膜離子梯度貯存的電化學(xué)勢能轉(zhuǎn)化為旋轉(zhuǎn)運動機械能的裝置,位于鞭毛的基底部,由轉(zhuǎn)子(rotor)和定子(stator)組成。MotA和MotB是跨膜蛋白,二者共同組成質(zhì)子通道,MotA/MotB復(fù)合體構(gòu)成馬達中的非旋轉(zhuǎn)部分,即定子。而FliG、FliM和FliN在鞭毛基底部形成一個功能復(fù)合體,稱為切換復(fù)合體(switchingcomplex),構(gòu)成了馬達的轉(zhuǎn)子,它可以決定鞭毛的旋轉(zhuǎn)方向。在復(fù)合體內(nèi),這些切換蛋白可以相互作用,而且FliG可與MotA結(jié)合從而連接轉(zhuǎn)子和定子。2.3chey的磷酸化刺激信號由受體復(fù)合體到鞭毛-馬達復(fù)合體的傳遞需要由CheY調(diào)節(jié)完成。CheY屬于“二元調(diào)控系統(tǒng)”中的調(diào)節(jié)蛋白,大小為14kD,具有多重功能。一旦CheA自身磷酸化,它就能快速地將磷酸基團轉(zhuǎn)移到CheY的Asp57。CheY的磷酸化導(dǎo)致構(gòu)象的變化,減少了CheY對CheA的親和力,提高了與FliM蛋白(鞭毛-馬達復(fù)合體的一個組成部分)的親和力。結(jié)果,當(dāng)磷酸化的CheY(CheY-P)從受體復(fù)合體上釋放出來之后,它在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)迅速擴散,并通過FliM與鞭毛-馬達復(fù)合體相互作用。這種依靠磷酸化的相互作用的最終結(jié)果是鞭毛CW旋轉(zhuǎn)的可能性增加了,細(xì)菌開始做一種翻筋斗式的運動。2.4chy蛋白活性的調(diào)節(jié)細(xì)菌趨化性反應(yīng)調(diào)節(jié)機制的關(guān)鍵就在于CheY蛋白的活性調(diào)節(jié),它的磷酸化和乙?；癄顟B(tài)都能直接影響CheY與其他蛋白的結(jié)合能力,從而調(diào)節(jié)細(xì)菌鞭毛的旋轉(zhuǎn)方向,進而決定細(xì)菌的運動方式。2.4.1chy磷酸化的結(jié)構(gòu)目前,來源于多種微生物中的CheY結(jié)構(gòu)都被解析清楚,以大腸桿菌為例,CheY擁有典型的反應(yīng)調(diào)節(jié)子結(jié)構(gòu),有1個結(jié)構(gòu)域,由5個α-螺旋和5個β-折疊構(gòu)成。分別位于β1、β3和β5羧基端的Asp13、Asp57和Lys109構(gòu)成了CheY的活性中心。其中,Asp13對于Mg2+的結(jié)合是必需的,Lys109通過它的ε-氨基與Asp57的羧基形成氫鍵。而既然Asp57是CheY的磷酸化位點,那么當(dāng)CheY磷酸化后Lys109和Asp57的相對位置就有可能發(fā)生改變,以容納Asp57上連接的磷酸基團。事實上,Lys鏈柔韌性很好,因此,Asp57的磷酸化就有可能造成活性中心的重排及Lys109構(gòu)象的變化。2001年,Lee等用BeF3-CheY的結(jié)構(gòu)模擬了磷酸化的CheY結(jié)構(gòu),與P-CheY類似,BeF3-CheY與FliM和CheZ的親和力增強,而與CheA的親和力降低。對比CheY的活性狀態(tài)與非活性狀態(tài)的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),激活后的CheY結(jié)構(gòu)只有少量改變。這些變化主要集中在β4/H4轉(zhuǎn)角,此區(qū)域在非活性狀態(tài)的CheY中是較柔韌的,并且是與FliM結(jié)合的區(qū)域的一部分。2.4.2shey功能的調(diào)整CheY蛋白可以發(fā)生兩種化學(xué)修飾:磷酸化和乙?；?。因此,它就有兩種不同的活性調(diào)節(jié)方式。2.4.2.chys磷酸化的去除cyCheY可在Asp57位發(fā)生磷酸化,由CheA或一些小分子如乙酰磷酸提供磷酸化基團。盡管乙酰磷酸在細(xì)胞內(nèi)普遍存在,而且其水平隨著生長階段和條件而改變。事實上,乙酰磷酸調(diào)節(jié)的CheY磷酸化的速度要遠低于CheA調(diào)節(jié)的磷酸化。因此,在體內(nèi)乙酰磷酸對CheY的磷酸化貢獻可能較小,但在體外卻是一種較為有效的CheY磷酸化方式。一直以來,人們都認(rèn)為磷酸化的CheY(CheY-P)與FliM的結(jié)合力增強,從而使鞭毛CW的頻率增加,細(xì)菌呈現(xiàn)翻滾行為。但是,Sarkar等于2010年研究發(fā)現(xiàn),CheY-P還能與FliN蛋白結(jié)合,進一步也能使細(xì)菌鞭毛CW的頻率增加。另外,CheY-P還可發(fā)生去磷酸化,去磷酸化酶CheZ可以加速它的去磷酸化過程,從而降低它與FliM的結(jié)合,最后終止鞭毛的CW。研究表明,CheZ的C端負(fù)責(zé)與CheY結(jié)合。而一旦CheY-P與FliM結(jié)合,CheZ就不能催化它的去磷酸化,因為它只能催化尚未結(jié)合的CheY-P的去磷酸化。2.4.2.chys的乙?；?004年,Barak等首次用純化的E.coli的乙酰輔酶A合成酶(Acs)證實它在體外可將CheY乙?；Ａ硗?通過質(zhì)譜分析,CheY的6個Lys乙?；稽c被鑒定出來,分別是:Lys91、92、109、119、122和126。這些乙?；稽c都集中在CheY的C端,正好是CheY與CheA,CheZ和FliM結(jié)合的區(qū)域。隨后,Barak等于2006年報道CheY可以利用AcCoA作為乙酰基來源而發(fā)生自乙?；Ａ硗?有研究人員還提出在細(xì)菌體內(nèi)存在一種未知的乙酰轉(zhuǎn)移酶也可以催化CheY的乙?；heY的去乙?；袃煞N方式,一種是由Acs負(fù)責(zé)催化的去乙酰化,另外一種是由沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silenceinformationregulator2,Sir2)在細(xì)菌中的同源蛋白CobB催化的依賴于NAD+的去乙?；^程。而且,細(xì)菌體內(nèi)的試驗證明后一種方式起主要作用。2008年Yan等在細(xì)菌體內(nèi)能直接測到CheY的乙?；?。2010年,Li等發(fā)現(xiàn)cobB敲除株CheY乙?；矫黠@增高,但對刺激物的趨化反應(yīng)能力下降。同時,他們還證明乙酰化降低了CheY與FliM之間的親和力。而Liarzi等也發(fā)現(xiàn)CheY的乙酰化會影響它與CheA、CheZ和FliM的結(jié)合。由此可見,CheY的乙?；_實能影響細(xì)菌的趨化性。但由于其乙?；俣容^慢,因此人們認(rèn)為,與磷酸化這種快速的調(diào)節(jié)方式相比,乙?；且环N較慢的調(diào)節(jié)細(xì)菌趨化性的方式。2.4.2.chey的磷酸化和乙酰化2004年,Barak和Eisenbach在體外研究發(fā)現(xiàn),CheY的磷酸化與乙?；@兩種修飾并非孤立進行,而是可以相互影響。如CheY的磷酸基來源——CheA及乙酰磷酸可以強烈抑制CheY的乙酰化,而CheZ則與之相反,可以增強CheY的乙?；?。另外,Acs可以提高CheA和CheY的磷酸化水平。2010年,Li等通過構(gòu)建cheA和cheZ的敲除菌株在細(xì)菌體內(nèi)證實CheY的磷酸化與乙?；_實相互影響、相互調(diào)節(jié)的。但兩者相互調(diào)節(jié)的具體機制還有待進一步深入研究。3chy的乙?；盘柺荏w受體抗體研究細(xì)菌趨化性對于利用細(xì)菌治理環(huán)境、控制病原菌侵染機體,以及開發(fā)微生物工業(yè)項目等方面都具有重要意義。隨著人們對細(xì)菌趨化性信號傳導(dǎo)及調(diào)節(jié)機制研究的不斷深入,新問題也不斷出現(xiàn)。第一,除了已知的向CheY傳遞磷酸化的信號受體復(fù)合體之外,是否還存在