大豆疫霉根腐病原菌毒素提取方法的研究

大豆疫霉根腐病原菌毒素提取方法的研究

大豆霉菌（phyto腐生）是由大豆霉引起的毀滅性疾病。該病于1948年首次在美國(guó)的印地安那州發(fā)現(xiàn)。雖然它的起源相對(duì)較晚，但它卻是危害大田作物的唯一的疫霉病害，迄今在世界大豆主產(chǎn)區(qū)呈擴(kuò)大蔓延趨勢(shì)。疫霉根腐病的侵染過程是在疫霉根腐病菌與大豆相互適應(yīng)的基礎(chǔ)上完成的。在適宜環(huán)境條件下，疫霉根腐病菌對(duì)大豆致病能力大小取決于它們所具有致病因子多少和活性的大小。現(xiàn)已知的病原生物的致病因子主要包括：酶、毒素、激素。由于毒素作為由病原菌產(chǎn)生的對(duì)寄主有毒害作用的次生代謝物在病菌致病過程中起著重要作用而倍受關(guān)注。目前，關(guān)于大豆疫霉根腐病菌毒素的研究涉獵還很少，幾乎是空白。因此，筆者于2004年8月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆所開放實(shí)驗(yàn)室，對(duì)大豆疫霉根腐病菌毒素進(jìn)行了提取及生物活性測(cè)定試驗(yàn)，為研究病原菌的致病機(jī)理奠定一定的理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1生物化學(xué)中的毒素提取由于國(guó)內(nèi)外還沒有文獻(xiàn)有關(guān)于大豆疫霉根腐病原菌毒素的報(bào)道，并且已知的病原菌毒素都為有機(jī)類物質(zhì)，所以大豆疫霉根腐病原菌毒素只能參照有機(jī)化學(xué)和生物化學(xué)中一些常用的用于提取毒素的方法，如浸提、吸附、萃取、結(jié)晶、重結(jié)晶、離心、超濾、分級(jí)沉淀及色譜技術(shù)。其中最常用的方法是萃取，萃取溶劑一般有兩種：一種是水溶性毒素或極性較強(qiáng)的毒素常采用水或強(qiáng)極性有機(jī)溶劑如甲酸、乙酸提取;另一種是弱極性或中性毒素,常采用極性較弱的有機(jī)溶劑如乙酸乙酯、氯仿、乙醚等萃取。筆者分別用極性不同的有機(jī)溶劑對(duì)大豆疫霉根腐病原菌的培養(yǎng)濾液進(jìn)行萃取。以期摸索出一個(gè)較適宜的毒素提取方法。1.2.2大豆切根苗毒素生物活性的測(cè)定用毒素代替病原菌作為研究工具，無論在理論上還是在應(yīng)用上都有著極其重要的意義，這不僅是因?yàn)樗梢韵镩g互相干擾和污染的復(fù)雜情況，而且由于方法簡(jiǎn)便、精確，極易定量等特點(diǎn)，在分子水平上探討和深化研究寄主與病原物間的相互作用有極大的便利。用毒素的生物測(cè)定方法目前為止也多達(dá)上百種，其中包括生物檢測(cè)：如用整株、組織器官、細(xì)胞、細(xì)胞器、亞細(xì)胞器等。筆者用生物檢測(cè)中的整株水平的切根苗浸漬法作為大豆疫霉根腐病原菌毒素生物活性的測(cè)定方法。在25℃恒溫室內(nèi)，取綏農(nóng)10(抗)和合豐25(感)的切根苗(真葉完全展開，苗齡為10d)各8株浸于稀釋20、50、100、200倍不同濃度的毒素粗提液中，處理24～72h，記載病狀，同時(shí)設(shè)無菌水為對(duì)照，重復(fù)3次。大豆切根苗病癥分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無癥狀(免疫)；0.5級(jí)：僅子葉萎蔫(高抗，HR)；1級(jí)：子葉萎蔫，真葉葉柄倒掛，莖維管束輕度變色(抗，R)；1.5級(jí)：子葉、真葉萎蔫，莖維管束褐色(中感，MS)；2級(jí)：全株萎蔫或真葉脫落，莖維管束嚴(yán)重變色，基部完全倒伏(高感，HS)。2結(jié)果與分析2.1毒素母液的制備將在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)10d的菌種用打孔器在胡蘿卜瓊脂平板上打成直徑為12mm的菌絲塊，在無菌條件下接種到盛有50mlFries培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，培養(yǎng)基的pH值為6.5，培養(yǎng)條件為28℃、靜止、半光照下10d。培養(yǎng)液經(jīng)濾紙過濾、離心，所得到的濾液為無菌絲體的毒素濾液。筆者研究的大豆疫霉根腐病代謝物用強(qiáng)極性的溶劑萃取過，但其提取活性極其微弱。用極性較弱的有機(jī)溶劑乙酸乙酯、氯仿、乙醚等后效果較好，且尤以乙醚萃取毒素的方法最為理想。參照高必達(dá)、吳畏等方法用等體積的分析純乙醚萃取三次,合并乙醚相,將萃取液在38℃用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海醫(yī)療專機(jī)廠)減壓蒸發(fā),殘?jiān)?00ml無水乙醇溶解,再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘?jiān)械乃?最終產(chǎn)物用無菌水溶解,定容至培養(yǎng)物濾液總體積的1/100,即為毒素母液。將毒素母液用無菌水稀釋20、50、100、200倍(其毒素濃度分別為培養(yǎng)物濾液中的毒素濃度的5、2、1、0.5倍)，即分別為0.4485、0.1794、0.0897、0.0449mg/ml。2.2不同毒素處理對(duì)抗感品種生長(zhǎng)和抗病的影響由圖版Ⅰ可以看出：20×濃度的毒素處理抗感品種綏農(nóng)10和合豐25的切根苗植株：在24h后，不論是抗病品種還是感病品種基部莖均出現(xiàn)維管束變褐，并萎蔫皺縮出現(xiàn)基部倒伏，但子葉與真葉還保持的綠色具有一定的生命力；在處理48h后，子葉和真葉均出現(xiàn)枯萎；72h后，抗感品種整個(gè)植株死亡。50×濃度的毒素處理抗感品種綏農(nóng)10和合豐25的切根苗植株：在24h后，抗感之間有著一定的差異，感病品種合豐25子葉出現(xiàn)，莖基部有些許變褐。而抗病品種綏農(nóng)10子葉葉面上出現(xiàn)凹痕，子葉輕度萎蔫，但莖部無明顯的變化；48h后，抗感品種的癥狀都有加重表現(xiàn)，感病品種的莖基部出現(xiàn)輕度皺縮，子葉萎蔫更加嚴(yán)重，抗病品種莖基部也出現(xiàn)變褐皺縮現(xiàn)象；72h后發(fā)現(xiàn)抗感品種均出現(xiàn)了倒伏癥狀，但抗病品種的子葉和真葉基本上生命力還比較旺盛，感病品種只有真葉還保持一定的生命力。100×濃度毒素處理抗感品種綏農(nóng)10和合豐25的切根苗植株：在24h后，抗感品種在外觀上與對(duì)照均沒有明顯差別。處理48h后，100×濃度處理的感病品種合豐25的子葉周邊開始出現(xiàn)萎蔫凹陷，莖基部有些變褐變軟現(xiàn)象，抗病品種綏農(nóng)10子葉表面也有一些凹痕，但莖部較對(duì)照無明顯的變化；72h后，感病品種合豐25徹底倒伏，而抗病品種綏農(nóng)10雖然葉部的萎蔫加重，但整個(gè)植株生命力還是很強(qiáng)。200×濃度毒素處理抗感品種綏農(nóng)10和合豐25的切根苗植株：72h后，除感病品種子葉葉面上有少許凹陷萎蔫外，其余組織與抗病品種和對(duì)照幾乎無差異。可見，毒素濃度的大小直接影響到致病的效果。在4種濃度處理下，20×和50×濃度毒素由于毒素含量相對(duì)較高，抗感品種均發(fā)病而不能鑒別出抗感品種在抵御病害時(shí)的差別。200×濃度毒素由于毒素含量相對(duì)較低，侵襲力差抗感品種均未出現(xiàn)明顯癥狀也無法鑒別抗感品種的差別。只有100×濃度毒素處理時(shí)，抗感品種在72h后與下胚軸接種大豆疫霉根腐病原菌時(shí)相同的表現(xiàn)，抗感之間有較大的差別。3結(jié)論4討論4.1進(jìn)行靈活分離的抗菌材料研究中，筆者采用疫霉根腐病原菌毒素代替病原菌進(jìn)行研究，有其獨(dú)特方便之處。可以在人為控制條件下，不受環(huán)境等的影響，準(zhǔn)確、快速得出結(jié)果。用毒素代替病原物，就可簡(jiǎn)化或克服許多因子變化而影響試驗(yàn)結(jié)果，并且有助于人們更加深入地了解病原菌的特性。這是毒素的研究在實(shí)際應(yīng)用上的一個(gè)體現(xiàn)。筆者只是在離體條件下用液體培養(yǎng)基來培養(yǎng)疫霉根腐病菌提取的毒素，在以后的工作中，還要進(jìn)行活體毒素提取條件的摸索，并比較活體和離體條件下大豆疫霉根腐病菌毒素組分上的差別；在國(guó)外的研究中已經(jīng)分離出53個(gè)生理小種，其親緣關(guān)系或起源早晚的鑒定除了用一些分子生物技術(shù)來鑒別外，毒素的研究為之提供了一個(gè)新的思路。4.2大豆疫霉根腐病原菌毒素的檢測(cè)大豆與疫霉根腐病菌毒素的相互作用是一個(gè)復(fù)雜的過程：這個(gè)過程以毒素處理大豆開始，以大豆產(chǎn)生抗病或感病反應(yīng)而告終。這包括大豆與疫霉根腐病菌毒素的相互識(shí)別作用以及由此產(chǎn)生的一系列生理生化反應(yīng)。據(jù)近年來的報(bào)道，無論是寄主?；远舅剡€是非寄主?；远舅兀鼈兙哂屑ぐl(fā)子和抑制子的功能。筆者的研究結(jié)果表明，只有100×濃度毒素處理時(shí)，抗感品種在72h后與下胚軸接種大豆疫霉根腐病原菌時(shí)相同的表現(xiàn)，抗感之間有較大的差別。由此可以看出，疫霉根腐病原菌毒素既有激發(fā)子的效應(yīng)，又有抑制子的效應(yīng)，在高濃度時(shí)，主要是起到了抑制子的功效，在濃度適宜時(shí)，既可以啟動(dòng)抗病植物細(xì)胞的抗性酶系，又能發(fā)揮類似抑制子的功能導(dǎo)致感病植物發(fā)病。適宜濃度的毒素才能鑒別出抗感大豆品種在抗性上的差異，這一試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了大豆疫霉根腐病原菌毒素是一種非寄主?；远舅?，它是由大豆疫霉根腐病原菌產(chǎn)生的一類對(duì)寄主植物具有一定生理活性和非?；宰饔梦稽c(diǎn)的代謝物毒素。在應(yīng)用該毒素時(shí)，必須調(diào)節(jié)毒素的濃度、毒素的作用時(shí)間等因素達(dá)到抗感品種間的敏感性差異。3.1大豆疫霉根腐病菌毒素的提取采取弱極性的有機(jī)溶劑