第五章細胞工程制藥

第五章細胞工程制藥第一節(jié)細胞融合與單克隆抗體生產(chǎn)制備技術(shù)第二節(jié)動物細胞工程制藥第三節(jié)植物細胞工程制藥第四節(jié)微生物細胞工程制藥第五節(jié)生物反應器第一節(jié)細胞融合與單克隆抗體生產(chǎn)制備技術(shù)

一、B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)二、單克隆抗體的制備三、人單克隆抗體1975年首次用B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體隨基因工程抗體技術(shù)相繼出現(xiàn)的單域抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、重構(gòu)抗體、雙功能抗體一、B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)細胞克隆抗原物質(zhì)通常具有多個不同結(jié)構(gòu)的抗原決定簇，能刺激多個B細胞克隆產(chǎn)生反應每一個B細胞克隆只能產(chǎn)生針對單一抗原決定簇的復數(shù)個抗體，但這些抗體對同一抗原決定簇又有著不同的親和性；即使抗原含有單一決定簇，仍能刺激多個B細胞克隆產(chǎn)生反應用某種抗原使動物免疫得到的抗血清中的抗體是來自多克隆的，是復雜的混合物。要從抗血清中分離、精制某特定的單一抗體是極其困難的一、B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)

Burnet提出的克隆選擇理論假定一種漿細胞只產(chǎn)生1種類型的免疫球蛋白分子，從一個單克隆細胞產(chǎn)生的抗體分子就是單克隆的。這些抗體具有特異性、同質(zhì)性，稱為單克隆抗體（McAb）1975G.Kohler和C.Milstein在細胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立了淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，第一次成功獲得單克隆抗體以骨髓瘤細胞和B淋巴細胞融合所產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體，就是B淋巴細胞雜交瘤技術(shù)或稱單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體的特點和應用單克隆抗體的特點：高度特異性；高度穩(wěn)定性；高抗體活性；不可知性；過于單一性單克隆抗體的應用免疫學、細菌學、遺傳學、腫瘤學、臨床診斷(鑒別細胞分化類型與成熟程度、同位素標記對腫瘤細胞進行追蹤、定位)、腫瘤的靶向治療（生物導彈），存在問題包括一些腫瘤缺少很特異的標記物、一些原發(fā)瘤標記物發(fā)生改變、單克隆抗體的人源化問題McAb技術(shù)生產(chǎn)各種疫苗（成本低又安全）二、單克隆抗體的制備骨髓瘤細胞株的選擇與培養(yǎng)免疫脾細胞的選擇與培養(yǎng)細胞融合雜交瘤細胞的選擇雜交瘤細胞克隆化雜交瘤細胞抗體性狀的鑒定骨髓瘤細胞株的選擇與培養(yǎng)（1）骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體（2）選擇缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的骨髓瘤細胞選擇對數(shù)生長期細胞：將骨髓瘤細胞株在融合前1周轉(zhuǎn)移到含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基上傳代(2-3代)，融合的前一天換液培養(yǎng)，使融合時細胞處于對數(shù)生長期（活細胞>95%)，保持細胞濃度不超過1x106個/mL,制備細胞懸浮液免疫脾細胞的選擇與培養(yǎng)（1）所選的免疫動物種系要與骨髓瘤細胞系一致或有相近親緣關(guān)系，一般采用與骨髓瘤供品系一致的動物如BALB/C系小白鼠的淋巴細胞與同種白鼠的骨髓瘤細胞融合，所得雜交瘤細胞的染色體穩(wěn)定，也能較理想的分泌目的抗體（2）所選的動物品系對抗原免疫應答要強細胞融合（1）細胞融合劑：40-50%的PEG4000，可在PEG溶液中加入DMSO（2）操作步驟：

A、培養(yǎng)后的骨髓瘤(NS-1株)和脾細胞懸液，分別用無血清RPMI1640培養(yǎng)基洗兩次后，進行活細胞計數(shù)

B、在室溫條件下脾細胞：NS-1細胞以2x108:2x107比例在離心管中混合，然后離心（1000r/min）10min。

C、去上清液，輕叩離心管使細胞散開，用吸管滴入0.5mL50%的PEG，用吸管尖輕輕攪拌細胞融合D、每隔0.5-1min,滴加1mL(37℃水浴預熱)無血清培養(yǎng)液，每次加后旋轉(zhuǎn)或輕攪拌，把細胞沉淀體變成勻質(zhì)的懸浮液，盡可能增加細胞接觸PEG的機會

E、融合過程不超過7min(滴加10次培養(yǎng)液)，離心去上清，加入培養(yǎng)基（含10%小牛血清）20mL懸浮，離心10min，去上清

F、含10%小牛血清的培養(yǎng)基洗兩次后再懸浮，并在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)過夜雜交瘤細胞的選擇

未融合的細胞比雜交瘤細胞增殖更快，應將融合后的細胞立即轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基中

HAT培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤、胸腺嘧啶和氨基蝶呤骨髓瘤細胞脾細胞(體外不能長期存活也不能增殖)雜交瘤細胞選擇操作方法如下：上述培養(yǎng)過夜的細胞混合物，離心，去上清用20mL的HAT-10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液懸浮懸浮液分注于96孔培養(yǎng)板，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)第1周每3天、第2周每2天換液（HAT培養(yǎng)液）1次，培養(yǎng)第2天培養(yǎng)液變黃立即換液從第3周改換HT-10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液;從第四周起換含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液ELISA檢測各孔培養(yǎng)的上清液，發(fā)現(xiàn)目的抗體陽性孔時，將細胞轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板繼續(xù)擴大培養(yǎng)微量、快速、特異、敏感、簡便、高通量酶聯(lián)免疫技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射性免疫技術(shù)雜交瘤細胞選擇過程流程圖雜交瘤細細的克隆化：

單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程，集團內(nèi)每個細胞的生物學特性和功能完全相同多數(shù)情況下初選的陽性克隆中不是來自單個細胞，可能混有不分泌目的抗體的克?。ㄩL的快）或遺傳不穩(wěn)定的雜交瘤細胞。為避免發(fā)生競爭性生長抑制，或發(fā)生變異不再產(chǎn)生抗體，以保證分泌性克隆生長的穩(wěn)定性，需要再進行3-4克隆化克隆培養(yǎng)方法：軟瓊脂法、有限稀釋法雜交瘤細胞抗體性狀的鑒定

（1）雜交瘤細胞的鑒定：染色體檢查分析（數(shù)目、形態(tài)）：染色體40+（54-64）；結(jié)構(gòu)上除多數(shù)為端著絲點外，還出現(xiàn)少數(shù)中部或亞中部著絲點的標志染色體；染色體數(shù)目較多且比較集中的雜交瘤細胞能穩(wěn)定分泌高效價的抗體細菌、霉菌、支原體檢查

雜交瘤細胞抗體性狀的鑒定（2）單克隆抗體的鑒定：抗體的特異性和交叉情況；抗體的類型和亞類；抗體的中和活性；抗體的親和力；抗體對應抗原的分子量；抗體識別的抗原表位單克隆抗體的大量制備：

動物體內(nèi)誘生法、體外培養(yǎng)法（1）動物體內(nèi)誘生法注入細胞的前幾周，進行同種小鼠腹腔注射刺激性有機溶劑降脂烷或液體石蠟，破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤細胞易于增殖的環(huán)境在接種雜交瘤細胞前1-2周，給小鼠注入0.5mL的異十八烷或液體石蠟，接種后1-2周開始取腹水（每次3-5mL），抽取幾次，在動物臨死前隔日取腹水1次，可達10mL.

優(yōu)點：操作簡便、經(jīng)濟、單克隆抗體量多且效價高、有效的保存雜交細胞瘤缺點：腹水中雜蛋白，難于純化；消耗大量活鼠。單克隆抗體的大量制備：體外培養(yǎng)法新獲得的雜交瘤細胞很不耐受稀釋，培養(yǎng)物逐步擴大A、含10%-20%胎?；蛐∨Ｑ宓腞PMI1640培養(yǎng)液：感染、純化難、批間差異大B、無血清培養(yǎng)C、微囊技術(shù)：培養(yǎng)完成后，收集發(fā)酵液，肝素處理，然后離心并分別收獲抗體（濃度達40-50%）和雜交瘤細胞（后者可在其他微囊中重新培養(yǎng)）評價體內(nèi)與體外培養(yǎng)、微囊法三、人克隆化抗體鼠源單克隆抗體：人抗鼠抗體反應（HAMA）；種屬不同的致敏反應人肺癌單克隆抗體LC-1存在問題：（1）致敏問題；體外免疫法效果差：人的外周血有大量T淋巴細胞的抑制細胞，B淋巴細胞又處在不同的分化階段。（2）雜交瘤細胞不穩(wěn)定（3）轉(zhuǎn)化細胞不穩(wěn)定（4）抗體的生產(chǎn)問題（5）人-鼠雜交瘤細胞人克隆化抗體由于人-人雜交瘤接種于動物遭到強烈的種間排斥，迫切需要解決無血清體外培養(yǎng)基因工程抗體解決：降低鼠源性單克隆抗體分子的免疫原性降低抗體的相對分子質(zhì)量，以增加組織的透過性，如單鏈抗體、單域抗體第二節(jié)、動物細胞工程一、動物細胞工程的類別二、動物細胞工程的特性三、動物細胞的培養(yǎng)基四、動物細胞的培養(yǎng)技術(shù)五、動物細胞的種質(zhì)保存技術(shù)六、動物細胞融合技術(shù)七、動物細胞單克隆抗體技術(shù)（略）八、動物細胞大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)九、動物細胞實例一、動物細胞工程的類別1、人工授精2、胚胎移植3、體外受精4、哺乳動物孤雌生殖5、嵌合體技術(shù)6、性別選擇7、細胞融合8、染色體重組和改造一、動物細胞工程的類別9、基因及細胞器的轉(zhuǎn)移10、細胞大規(guī)模培養(yǎng)11、動物細胞反應器12、動物細胞反應動力學13、單克隆抗體技術(shù)二、動物細胞工程的特性1、細胞生長緩慢，易受雜菌污染，培養(yǎng)時需要加抗生素。2、動物細胞無細胞壁，機械強度低，適應環(huán)境能力較差。3、培養(yǎng)過程中需氧量少，不耐受強力通風和攪拌。4、動物細胞在培養(yǎng)過程中常常相互粘連，具有群體效應、錨地依賴性、接觸抑制性。5、培養(yǎng)產(chǎn)物多是分布于細胞內(nèi)外，培養(yǎng)過程成本較高。二、動物細胞工程的特性6、大規(guī)模培養(yǎng)時，不可套用微生物的培養(yǎng)技術(shù)。7、原代細胞在進行繼代操作時，一般于50代后就告退化死亡。8、動物細胞工程的無菌特性（下面講解）動物細胞工程的無菌特性消毒要求---高壓蒸汽消毒，干燥高溫消毒，紫外線,化學方法,過濾除菌等：（1）高壓蒸汽消毒：依賴濕熱而非高壓消毒，常用121度，15—20分鐘（2）干燥高溫消毒：160度，90分鐘（3）紫外線：直接照射，但注意會產(chǎn)生臭氧，并對身體有害。（4）消毒劑：新潔而滅、70％酒精、過氧乙酸（5）過濾除菌：血清、合成培養(yǎng)液、酶液等含有蛋白質(zhì)，具有生物活性，不能采用高溫、高壓消毒的方法進行滅菌，因此須采用過濾除菌。三、動物細胞的培養(yǎng)基動物細胞的培養(yǎng)基組成----氨基酸、葡萄糖、蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)、維生素、輔酶、激素、生長因子、微量元素、緩沖系統(tǒng)。1、培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境2、培養(yǎng)液要求3、平衡鹽溶液（BSS）4、天然培養(yǎng)基5、合成培養(yǎng)基6、無血清培養(yǎng)基1、培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境適宜的溫度----人和哺乳動物培養(yǎng)細胞最適溫度均為35－37℃。氣體環(huán)境和氫離子濃度----需要一定量的O2（1995－9975pa）和CO2（95％空氣+5%CO2）；pH7.2-7.4營養(yǎng)物質(zhì)----適當?shù)呐囵B(yǎng)基環(huán)境無毒和無菌滲透壓2、培養(yǎng)液要求氨基酸---氮源鹽類---鈉離子，鉀離子，鎂離子，鈣離子，氯離子，硫酸根離子，磷酸根離子，碳酸氫根離子等葡萄糖：供能緩沖系統(tǒng)---CO2緩沖系統(tǒng)或HEPES（羥乙基哌嗪乙硫磺酸）生長因子---PDGF，EGF，F(xiàn)GF等其它成分---維生素，礦物，有機補充物，激素等3、平衡鹽溶液（BSS）

功效：①維持滲透壓②提供緩沖系統(tǒng)③提供水分和無機鹽4、天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基如----血清，血漿，組織浸出液等優(yōu)點----營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點----來源受限。成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染天然培養(yǎng)基的類型：[A]乳蛋白水解物培養(yǎng)基[B]酪蛋白水解物培養(yǎng)基[C]血清及胚胎浸出液培養(yǎng)基5、合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基--是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。優(yōu)點--標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定，成本低。缺點--缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。目前常用合成培養(yǎng)基＋血清來培養(yǎng)細胞5、合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基的類型：（A）Eagle培養(yǎng)基（內(nèi)含13種氨基酸、9種維生素、多種無機鹽）（B）Ham氏F10培養(yǎng)基（內(nèi)含20種氨基酸、多種維生素、10種無機鹽）（C）TC199培養(yǎng)基（D）Waymouth氏MB752/1培養(yǎng)基（E）NCTC109培養(yǎng)基6、無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基----在合成培養(yǎng)基中加入起血清作用的種類激素和生長因子，如鐵轉(zhuǎn)運蛋白、乙醇胺、胰島素、硒、氫化可的松、維生素C、促胃激素等等。血清的成分：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分四、動物細胞的培養(yǎng)技術(shù)（一）動物細胞培養(yǎng)的基本概念（二）可供進行動物細胞培養(yǎng)的材料（三）動物組織塊培養(yǎng)法（四）動物細胞單層培養(yǎng)法（五）單細胞分離培養(yǎng)（六）單細胞微量板克隆技術(shù)（七）二倍體細胞培養(yǎng)（八）傳代細胞株的培養(yǎng)（一）動物細胞培養(yǎng)的基本概念1、動物細胞培養(yǎng)的定義2、動物細胞培養(yǎng)的歷史3、動物細胞培養(yǎng)的優(yōu)點4、動物細胞培養(yǎng)的類別5、培養(yǎng)細胞的特性6、動物細胞培養(yǎng)所需儀器設備1、動物細胞培養(yǎng)的定義

動物細胞與組織培養(yǎng)是從動物體內(nèi)取出細胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。2、動物細胞培養(yǎng)的歷史（1）開始----1907，Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液內(nèi)，培養(yǎng)出神經(jīng)元。（2）成熟----以人的腫瘤細胞與組織為材料建立的各種細胞系，如Hela細胞系。3、動物細胞培養(yǎng)的優(yōu)點（1）

細胞經(jīng)培養(yǎng)后形成的細胞系和細胞株，特征均一。（2）理化環(huán)境可控制，培養(yǎng)物可直接被觀測。（3）提供大量均一的細胞供制備用。（4）便于進行人工篩選。（5）結(jié)合顯微電影技術(shù)，可觀察細胞代謝活動和反應。目前，動物細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于病毒學，免疫學，遺傳學，腫瘤學，分化及發(fā)育，細胞毒理試驗，生物技術(shù)等各個領(lǐng)域。4、動物細胞培養(yǎng)的類別1、動物組織培養(yǎng)2、動物細胞培養(yǎng)（1）細胞團塊單層培養(yǎng)（2）單細胞克隆株培養(yǎng)3、原代細胞培養(yǎng)（1）初代培養(yǎng)（2）細胞株確立培養(yǎng)4、細胞繼代培養(yǎng)5、轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)6、工程細胞系的培養(yǎng)5、培養(yǎng)細胞的特性懸浮型--懸浮在溶液中貼壁型：[A]上皮細胞型[B]成纖維細胞型[C]游走細胞型[D]多形細胞形（1）動物細胞貼壁生長特性（2）動物細胞接觸抑制特性（3）動物細胞培養(yǎng)一代生長過程（1）動物細胞貼壁生長特性（2）動物細胞接觸抑制特性細胞從接種到長滿底物表面后，由于細胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。（3）動物細胞培養(yǎng)一代生長過程（1）游離期（2）指數(shù)生長期（3）穩(wěn)定期（4）衰退期6、動物細胞培養(yǎng)所需儀器設備實驗室要求（A）和緩沖間相連，緩沖間內(nèi)備消毒服裝和鞋，口罩等，入內(nèi)換上。（B）室內(nèi)空氣不流通，有適當?shù)墓饩€，清潔，干燥.萬級。（C）側(cè)部可設傳遞窗，用于物品傳遞。（D）有消毒用紫外線燈（1）培養(yǎng)器具（2）超凈工作臺（3）CO2培養(yǎng)箱（4）倒置顯微鏡（5）純化水裝置（1）培養(yǎng)器具培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板培養(yǎng)皿（2）超凈工作臺超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。100級超凈工作臺指標：（≥0.5цm≤3.5粒/L）

（3）CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2。二氧化碳的作用：維持PH值。（4）倒置顯微鏡

（5）純化水裝置（二）可供進行動物細胞培養(yǎng)的材料1、胚胎組織------如10—20日齡的雞胚、實驗動物胚胎、人工流產(chǎn)的胎兒。胚胎組織的細胞由于互相之間粘連作用較弱、易于消化和分散、并且其細胞生命力強，易于培養(yǎng)和增殖。2、成體組織------如肝臟、脾臟、心臟、腎臟、白血球等等，由于其細胞之間具有較強的粘合作用，培養(yǎng)難度較大。3、腫瘤組織-----細胞增殖能力強，可在體外長期培養(yǎng)和繁殖，并且可以采用微生物培養(yǎng)方法進行懸浮培養(yǎng)。（三）動物組織塊培養(yǎng)法將動物組織切成直徑為1—2mm的小塊、并且進行培養(yǎng)的方法稱為動物組織塊培養(yǎng)法。有些動物組織如人的皮膚細胞，由于分散成細胞十分困難，因此常常采用組織塊培養(yǎng)法。動物組織塊培養(yǎng)法又可分為三種不同的培養(yǎng)方法：

（1）血漿凝固培養(yǎng)法

（2）膠原固著培養(yǎng)法

（3）無基質(zhì)固著培養(yǎng)法動物組織塊固著之后，加培養(yǎng)液，于37℃、CO2培養(yǎng)箱中、通入含5%CO2的空氣進行培養(yǎng)，即可在組織塊周圍長出新的細胞單層。動物組織培養(yǎng)過程中，進行旋轉(zhuǎn)或者振蕩，培養(yǎng)效果更好。（四）動物細胞單層培養(yǎng)法動物組織塊經(jīng)過消化分散成單細胞或者細胞團塊之后，粘附于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)成新生細胞單層的方法稱為動物細胞單層培養(yǎng)法。動物細胞單層培養(yǎng)法包括二個過程：1、組織塊分散成單細胞2、細胞培養(yǎng)1、組織塊分散成單細胞消化分散組織塊的方法分為三種：（1）酶消化法（2）物理分散法（3）酶消化與物理分散結(jié)合法

（1）酶消化法將組織塊切成1-2mm的立方小塊，置蛋白酶溶液中進行消化分散，離心收集細胞，經(jīng)過平衡鹽溶液洗滌，加培養(yǎng)基后于4℃條件下貯存?zhèn)溆谩Ｏ玫牡鞍酌赣校篈、胰蛋白酶----適用于大多數(shù)組織塊的消化，對組織塊的使用濃度為0.25%、對繼代細胞的濃度為0.1-0.25%，殘留的酶液對細胞有一定的毒害作用。小牛血清常常對細胞有保護作用。B、鏈霉蛋白酶----適用于分散多種組織塊，分散較為徹底，分散后的細胞不含團塊。但是酶殘留對細胞的毒性較大，并且小牛血清細胞沒有保護作用。C、膠原酶----適用于分散肝臟、心臟等含有膠原組織的細胞分散，對于細胞的毒性小，可用于克隆培養(yǎng)。若與胰蛋白合用，則分散效果更好。（2）物理分散法本法是將組織小塊通過加壓過篩的方法進行機械分散，其結(jié)果會形成單個細胞和細胞團塊，其優(yōu)點是細胞不受化學物質(zhì)的影響，其缺點是細胞損傷率較大，不宜用來分散胚胎組織。（3）酶消化與物理分散結(jié)合法本法是指動物組織先經(jīng)過酶消化，再用電磁攪拌的方法進行物理分散。組織小塊經(jīng)酶消化5-10分鐘之后，立即用電磁攪拌器在200轉(zhuǎn)/分鐘進行物理分散，每消化一次就收集一次細胞懸液，余下的組織塊再依次進行消化分散，直至消化完全，最后離心收集細胞，洗滌除去酶液，加培養(yǎng)基于4℃條件下貯存?zhèn)溆谩?、細胞培養(yǎng)上述細胞懸液經(jīng)過計數(shù)、稀釋之后，接種于無菌培養(yǎng)器中，加入培養(yǎng)液于37℃條件下培養(yǎng)，細胞即粘于瓶底或者轉(zhuǎn)瓶內(nèi)壁，并且開始生長形成單層。接種濃度：

上皮細胞1*105—3*105個/毫升。

成纖維細胞2*105—6*105個/毫升。

成體細胞應高于胚胎細胞。培養(yǎng)時間：

上皮細胞5—7天形成單層。成纖維細胞3—4天形成單層。培養(yǎng)條件：

動物細胞的需氧量較低，一般通入含5%CO2的空氣進行供氧，有利于維持培養(yǎng)基的PH值。培養(yǎng)方法（1）原代培養(yǎng)（2）傳代培養(yǎng)（1）原代培養(yǎng)定義：從新鮮供體取得組織細胞后在體外進行首次培養(yǎng)，一般持續(xù)1－4周。步驟：取材---組織分離---培養(yǎng)（2）傳代培養(yǎng)定義：當原代培養(yǎng)的細胞相互匯合時，細胞由原培養(yǎng)瓶消化、收集、稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程。注意：原代細胞類型不一，利用不同的消化時間和消化液。步驟：[A]貼壁細胞：去除培養(yǎng)基---胰蛋白酶消化---加入培養(yǎng)液，形成細胞懸液---稀釋---培養(yǎng)[B]懸浮細胞：收集細胞懸液---離心搜集細胞---用培養(yǎng)液稀釋---培養(yǎng)（五）單細胞分離培養(yǎng)單細胞分離培養(yǎng)也稱為細胞克隆培養(yǎng)，是指將單個細胞培養(yǎng)成純細胞系群的技術(shù)。由于動物細胞具有集群效應，單個細胞在培養(yǎng)基中難以生長。因此在克隆株培養(yǎng)過程中，常常采用：（1）使用條件培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。（2）在培養(yǎng)基中加入飼養(yǎng)細胞----如加入小鼠胸腺細胞和小鼠腹腔巨噬細胞。（六）單細胞微量板克隆技術(shù)1、微量板克隆技術(shù)2、單細胞微量板克隆技術(shù)的特點和應用1、微量板克隆技術(shù)微量板是指孔徑為6mm，容量為0.3ml的多孔培養(yǎng)板。常用的有96孔、55孔、24孔。細胞克隆時，將細胞稀釋成10個/毫升以下的懸浮液，然后向每1微孔中加入0.1毫升，則每1孔中的細胞數(shù)平均為1個。接種后在含5%CO2的空氣的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔4—8天更換一次新的培養(yǎng)液0.2ml，直到形成單克隆細胞株。繼代培養(yǎng)時，吸除培養(yǎng)液，用不含Ca、Mg的平衡鹽溶液沖洗，再用胰蛋白酶進行消化，然后用培養(yǎng)液洗滌，再轉(zhuǎn)移到25cm2表面的培養(yǎng)瓶中，加3ml培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，幾天后就會長成成片的新克隆細胞。2、單細胞微量板克隆技術(shù)的特點和應用微量板細胞克隆過程中，由于每一個克隆肯定來源于同一個細胞，其培養(yǎng)的重復性和可靠性均十分良好。微量板細胞克隆技術(shù)可用于建立純細胞株、檢查細胞遺傳性的一致性，還可用于分離細胞變種。微量板細胞克隆技術(shù)在評價藥物、毒物對細胞生長的影響、篩選淋巴細胞雜交瘤工程、基因和細胞工程、制備單克隆抗體工程中具有重要作用。（七）二倍體細胞培養(yǎng)1、二倍體細胞的培養(yǎng)意義2、二倍體細胞的來源3、二倍體細胞的培養(yǎng)特征1、二倍體細胞的培養(yǎng)意義二倍體細胞：（1）具有二倍性染色體（2n），染色體核型正常。（2）培養(yǎng)條件下只具有有限的生命力，不能進行無限期的分裂繁殖。（3）無致癌性。培養(yǎng)意義：二倍體細胞保留著所在組織正常的細胞性狀。（1）可用于生產(chǎn)疫苗、尿激酶、干擾素等藥物的生產(chǎn)。（2）也可用于細胞遺傳學、細胞分化及衰老的研究、以及藥物的細胞毒性、環(huán)境污染的細胞學檢測2、二倍體細胞的來源來源于3-4個月的胚胎肺組織。目前已獲得了多種人胚肺二倍體細胞，如：W1-38 MRC-5 MRC-9IMR-90 2BS KBM-13LS-7

3、二倍體細胞的培養(yǎng)特征影響二倍體細胞培養(yǎng)的因素有：（1）分種率-----一般不超過1：8，細胞密度應大于104個/平方厘米，否則死亡率大，細胞難以成層。（2）繼代壽命----細胞在生長到2/3PD時就應該進行繼代培養(yǎng)，否則細胞容易退化、衰老和死亡。（3）PH值----應大于7.2，最好通過CO2培養(yǎng)箱和有機緩沖液如HEPES來穩(wěn)定培養(yǎng)液的PH值。（八）傳代細胞株的培養(yǎng)1、傳代細胞株的定義2、傳代細胞株的條件3、傳代細胞株的建立4、已經(jīng)獲得確認的細胞株1、傳代細胞培養(yǎng)的定義正常細胞在繼代過程中，有些細胞的增殖力會突然增強，在特定條件下可以無限繁殖。同時與原代細胞相比，其形態(tài)、生理生化特性、病毒敏感性、抗原性、以及染色體的結(jié)構(gòu)上均發(fā)生了變化，并且具有致癌性。這類細胞就稱為傳代細胞。確立細胞株的培養(yǎng)也稱傳代細胞培養(yǎng)。傳代細胞不具有錨定依賴性、接觸抑制性和群體效應。同時也喪失了組織分化能力和臟器特異性。僅保留了種屬特異性。2、傳代細胞株的條件3、傳代細胞株的建立（1）細胞系---原代培養(yǎng)物首次傳代成功后即成細胞系。[A]有限細胞系[B]連續(xù)細胞系（2）細胞株---通過選擇從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標志的培養(yǎng)物。4、已經(jīng)獲得確認的細胞株

國際和國內(nèi)被命名的細胞系和細胞株都是一些形態(tài)比較均一、生長狀態(tài)比較穩(wěn)定和生物性狀相對清楚的細胞群。目前已經(jīng)獲得的確立細胞株有：[A]小鼠成纖維細胞（L-細胞）[B]人體子宮癌細胞（Hela-細胞）[C]肝癌細胞（BEL-細胞）[D]小鼠及人體骨髓瘤細胞4、已經(jīng)獲得確認的細胞株五、動物細胞的種質(zhì)保存技術(shù)1、種質(zhì)保存的必要性（1）動物細胞在連續(xù)的繼代培養(yǎng)中，容易污染和產(chǎn)生多種細胞混雜。（2）細胞株在繼代培養(yǎng)過程中常常發(fā)生變異。（3）二倍體細胞存在壽命限制，無法進行大多的傳代培養(yǎng)。2、保存形式（1）組織塊（2）細胞懸浮物（3）細胞單層培養(yǎng)物3、保存方法4、超低溫泠凍技術(shù)3、保存方法（1）常溫法----將特定的動物細胞于20--30℃下進行保存的方法。

如人羊膜細胞單層于28℃下可保存1個月。

人腎細胞單層于25--30℃下可保存1個月以上。

人二倍體細胞單層可保存二周，中間換液則可保存30天以上，（2）低溫法----將特定的動物細胞于4℃下進行保存的方法。

如人胚組織塊于4℃下可保存14—30天。（3）超低溫泠凍法----將特定的動物細胞于-70℃以下、或者在液氮中進行保存的方法。超低溫泠凍法可以長期保存動物細胞，如二倍體細胞2BS自1973年來保存至今，其遺傳性仍然沒有變化。4、超低溫泠凍技術(shù)（1）防凍劑準備（2）超低溫泠凍的具體方法（3）超低溫泠凍后的解凍方法

（1）防凍劑準備

超低溫泠凍法需要使用防凍劑，以減少細胞在凍結(jié)過程中所受到的損傷。常用的防凍保護劑有：甘油、DMSO。A、甘油----毒性較小，能夠結(jié)合水，減少組織結(jié)冰量，防止細胞內(nèi)鹽濃度升高，具有保護細胞的作用。其使用濃度一般為5—20%。B、DMSO----是目前應用較多的一種保護劑，使用濃度為5-12.5%，與甘油相比，DMSO的毒性更低、抗凍能力更強。（2）超低溫泠凍的具體方法

先配制8-10%的DMSO+15-20%的小牛血清+適量NaHCO3的保護液

↓

將細胞培養(yǎng)物消化、分散、離心，收集單細胞

↓

按5*106個/ml的濃度添加保護液，1ml/支分裝于安瓿瓶中

↓

0-4℃放置2-4小時

↓

移至-70℃以下的冰箱中、或者在液氮中進行保存（3）超低溫冷凍后的解凍方法將安瓿瓶取出，包裹4層紗布浸入40℃水中，振搖融化40秒

↓

混勻后立即接種到1-2瓶100ml的培養(yǎng)瓶中

↓

按1-2-4-8ml的方式依次加入生長液。最終加至20ml。注意事項[A]、保護液中含DMSO時，可直接用來接種。[B]、保護液含甘油時，應該離心除去甘油以防影響細胞增殖。六、動物細胞融合技術(shù)動物細胞融合技術(shù)----也稱動物體細胞雜交技術(shù)，是指二個或者二個以上的動物細胞在外力作用下，合并為一個多核細胞的過程。細胞膜蛋白質(zhì)重新分布是細胞融合的基礎(chǔ)。（一）促融因素（二）完整細胞之間的融合（三）核體、胞質(zhì)體與完整細胞之間的融合（四）微細胞與完整細胞之間的融合（五）脂質(zhì)體介導的細胞融合（六）融合后雜種細胞的篩選技術(shù)（一）促融因素1、病毒誘導融合2、PEG誘導融合3、電場誘導融合4、其它誘導融合（1）聚乙烯醇（2）離心力1、病毒誘導融合某些不同種屬的動物細胞在特定病毒、病毒外殼或者病毒碎片的作用下，可以發(fā)生融合作用。如仙臺病毒、流感病毒、新城疫雞瘟病毒、皰疹病毒等。當二種不同的動物細胞混合物中存在大量病毒時，病毒或其組分會在細胞間起粘連作用而使細胞聚集成團，細胞膜上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生重排、進而結(jié)合成一個整體。病毒所誘導的融合是隨機的，無法人為控制，同時融合率較低。2、PEG誘導融合當二種不同的動物細胞混合物中存在PEG時，就會產(chǎn)生細胞聚集作用。在除去PEG的過程中，即產(chǎn)生細胞融合現(xiàn)象。所用的PEG分子量在1000-6000之間，一般濃度為40-50%，在37℃下作用2-3分鐘，其促融效果最佳。PEG促融合的作用機理不清，其促融作用也具有隨機性，無法人為控制。3、電場誘導融合將二種細胞混合物經(jīng)過10-100V/cm的低強度非均勻交變電場作用時，細胞之間就會發(fā)生緊密接觸，形成穩(wěn)定的串珠狀偶極子排列。在此基礎(chǔ)上再對細胞實施瞬間高強度電脈沖就會發(fā)生膜擊穿，不同細胞間通過膜脂質(zhì)分子重排就能實現(xiàn)融合，形成一個雙核或者多核的細胞。一般來說，擊穿電壓為0.5-10KV/cm，作用時間為30-50微秒。電場誘導融合不損傷細胞，具有可人為操作的控制的特性，融合率較高。（二）完整細胞之間的融合取一定數(shù)量（107-108個/ml）的二種親本細胞，充分混合

→離心，取下層細胞懸液0.1ml

→逐滴加入0.4ml、37℃、40%的PEG溶液，37℃靜置90秒

→緩慢加入5-10ml無血清培養(yǎng)液，搖晃4-5次，離心，除去上清液

→每0.1ml細胞懸液加入25ml完全培養(yǎng)基，以每孔0.1ml分裝于96孔培養(yǎng)板上。

→37℃下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）核體、胞質(zhì)體與完整細胞之間融合具體過程分為二步：1、核體、胞質(zhì)體的制備2、核體、胞質(zhì)體與完整細胞之間的融合1、核體、胞質(zhì)體的制備2、核體、胞質(zhì)體與完整細胞之間的融合（1）按完整細胞的融合方式，可將核體與另一種完整細胞融合。（2）按完整細胞的融合方式，可將核體與另一種細胞的胞質(zhì)體融合。（3）按完整細胞的融合方式，可將胞質(zhì)體與另一種完整細胞融合。融合之后，能夠改變細胞的遺傳性狀、傳遞耐藥性以及雄性不育等性狀。（四）微細胞與完整細胞之間的融合一個或者幾個染色體外包裹一層細胞膜的小體，稱為微細胞。微細胞的制備方式是：

用秋水仙素處理處于對數(shù)生長期的動物細胞，終止細胞分裂

→此時，細胞核分裂成若干個微核，每個微核由1個-數(shù)個染色體所組成。

→再用細胞松馳素B處理，使得微核脫離細胞膜

→按完整細胞的融合方式，可將微核與另一種完整細胞融合。

→所獲得的融合子稱為微細胞雜種細胞。（五）脂質(zhì)體介導的細胞融合動物細胞破碎之后，經(jīng)過差相離心，可分離出線粒體、溶酶體等細胞器，甚至于可分離出RNA、DNA、逆轉(zhuǎn)錄酶和其它大分子。

→將上述細胞器包裝成脂質(zhì)體

→按完整細胞的融合方式，可將脂質(zhì)體與另一種完整細胞融合。

→可獲得相應的雜種細胞1、通過轉(zhuǎn)移細胞器獲得的雜種細胞，可以獲得抗藥性和抗毒性遺傳性狀。2、生物大分子的轉(zhuǎn)移，是細胞工程和基因工程的交匯點。（六）融合后雜種細胞的篩選技術(shù)篩選雜種細胞的目的是為了獲得性能優(yōu)良的雜合細胞。1、雜種細胞的篩選原理2、篩選系統(tǒng)1、雜種細胞的篩選原理將融合后的細胞混合物于選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，終止那些同型多核、異型多核細胞以及未能發(fā)生融合的親本細胞的生長繁殖，而僅僅允許異型雙核細胞繁殖。（1）同型多核融合細胞----無法合成DNA，而失去繁殖能力。（2）異型多核融合細胞----細胞核不能進行再次分裂，也失去繁殖能力。2、篩選系統(tǒng)（1）HAT選擇系統(tǒng)（2）抗藥性選擇系統(tǒng)（3）營養(yǎng)互補選擇系統(tǒng)（4）原位雜交法（略）（5）基因探針選擇法（略）（1）HAT選擇系統(tǒng)正常的動物細胞，其DNA的合成途徑有二條：全合成途徑----利用外源性營養(yǎng)物合成DNA。這一途徑能被氨基喋呤所阻斷。補救合成途徑----利用自身代謝產(chǎn)物中的游離嘌呤和嘧啶來合成。[A]、骨髓瘤細胞----骨髓瘤細胞能夠在體外長期分裂繁殖，但是其DNA合成存在著缺陷。當培養(yǎng)基中含有氨基喋呤（A）時，骨髓瘤細胞就無法正常生長。HPRT-型骨髓瘤細胞----屬于次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶缺陷型細胞，其嘌呤只能通過全合成途徑進行合成。（1）HAT選擇系統(tǒng)TK-型骨髓瘤細胞---屬于胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型細胞，其嘧啶只能通過全合成途徑進行合成。[B]、淋巴細胞----同時含有合成DNA的二條途徑，但是不能夠在體外長期分裂繁殖。在人工培養(yǎng)基中的存活時間只有1-2天。[C]、骨髓瘤細胞+淋巴細胞=雜交瘤細胞----既能夠在體外長期分裂繁殖，又能夠通過二條途徑合成DNA，HAT是含有次黃嘌呤（H）+氨基喋呤（A）+胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基。因此在帶有選擇性的HAT培養(yǎng)基中，只有雜交瘤細胞才能正常存活。（2）抗藥性選擇系統(tǒng)利用生物細胞對于藥物敏感性的差異程度，來篩選雜種細胞的方法，稱為抗藥性選擇系統(tǒng)。一種親本細胞M對藥物A敏感、同時對藥物B不敏感。另一種親本細胞N對藥物A不敏感、而對藥物B敏感。M+N融合后的雜合細胞P同時對藥物A、B均不敏感。那么，在同時含有藥物A、藥物B的選擇性培養(yǎng)基中

（A）親本細胞M不能生長

（B）親本細胞N也不能生長

（C）只有雜合細胞P才能在選擇性培養(yǎng)基中存活。這樣，經(jīng)過反復分離和繼代移植，就可以篩選出雜種細胞。（3）營養(yǎng)互補選擇系統(tǒng)生物細胞在缺乏某種營養(yǎng)成份時就不能生長，這種細胞稱為營養(yǎng)缺陷型細胞。A親本細胞為色氨酸缺陷型。B親本細胞為蘇氨酸缺陷型。A+B融合后的雜合細胞C則為非缺陷型。在同時不含色氨酸+蘇氨酸的選擇性培養(yǎng)基中。A、B親本細胞均不能正常生長而只有A+B融合后的雜合細胞C才能存活七、動物細胞大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是指在人工條件下，高密度大批量培養(yǎng)有用的動物細胞以生產(chǎn)藥品的技術(shù)（一）培養(yǎng)劑（二）培養(yǎng)技術(shù)（三）動物細胞工程制藥基本過程（一）培養(yǎng)劑1、含小牛血清的培養(yǎng)基----在培養(yǎng)基中添加5-10%的小牛血清。2、不含小牛血清的培養(yǎng)基----具體有三種類型

（1）基本合成培養(yǎng)基

（2）基本合成培養(yǎng)基+生長因子

（3）基本合成培養(yǎng)基+組織抽提物起血清作用的各類生長因子----鐵傳遞蛋白、乙醇胺、胰島素、促胃酸激素、維生素C、可的松、硒等等成份。（二）培養(yǎng)技術(shù)1、細胞懸浮培養(yǎng)法2、固定化培養(yǎng)法3、微載體培養(yǎng)法

1、細胞懸浮培養(yǎng)法（1）細胞懸浮培養(yǎng)法的概念（2）細胞懸浮培養(yǎng)法的工藝流程（3）細胞懸浮培養(yǎng)法的注意事項（1）細胞懸浮培養(yǎng)法的概念細胞在培養(yǎng)液中呈現(xiàn)懸浮生長繁殖的方法稱為細胞懸浮培養(yǎng)法。細胞懸浮培養(yǎng)法的具體方式有3種：批量法、半連續(xù)法、連續(xù)法。細胞懸浮培養(yǎng)法適用于培養(yǎng)傳代細胞株、雜交瘤細胞、腫瘤細胞、血液細胞和淋巴細胞?？捎脕泶罅可a(chǎn)疫苗、a-干擾素、白介素、淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體（McAb）。（2）細胞懸浮培養(yǎng)法的工藝流程由配料罐→培養(yǎng)液貯罐→平衡罐→前培養(yǎng)罐→主培養(yǎng)罐→培養(yǎng)液分離槽→離心→提取→干燥設備所組成。在配料罐內(nèi)配制培養(yǎng)液，經(jīng)過無菌過濾之后，送入培養(yǎng)液貯罐

→再次滅菌之后，送入平衡罐，調(diào)整氧化還原電位至70-100Mv，以提高細胞的生長繁殖速度

→送入前培養(yǎng)罐進行細胞增殖培養(yǎng)，再送入主培養(yǎng)罐生產(chǎn)和合成藥物

→培養(yǎng)后的細胞懸液送入收集罐和分離槽→離心→提取→干燥設備（3）細胞懸浮培養(yǎng)法的注意事項A、在培養(yǎng)過程中，為了保證細胞處于單顆粒均勻懸浮狀態(tài)，需要采用攪拌式反應器或者氣升式反應器，以較低的攪拌速度，并以一定速度通入含水量5%CO2的無菌空氣，來保證細胞處于懸浮狀態(tài)，并維持培養(yǎng)液中一定的溶解氧。B、為了使細胞不至于產(chǎn)生凝聚、成團或者沉淀，在培養(yǎng)基的基礎(chǔ)鹽溶液中不加Ca和Mg。同時間歇式或者連續(xù)地更換部份培養(yǎng)液。C、在進行動物細胞培養(yǎng)過程中，隨時檢測和控制培養(yǎng)過程的溫度、壓力、溶解氧、CO2、PH值、氧化還原電位、攪拌速度、通氣量、營養(yǎng)成份、（3）細胞懸浮培養(yǎng)法的注意事項D、細胞密度：在動物組織中的細胞密度為109個/ml，為自然界中的最高密度狀態(tài)。體外懸浮細胞培養(yǎng)狀態(tài)，細胞密度一般控制在5*106個/ml。在新穎的灌流培養(yǎng)系統(tǒng)中，細胞密度可達到107個/ml。2、固定化培養(yǎng)法（1）固定化培養(yǎng)法的定義（2）動物細胞的固定化培養(yǎng)方法（3）目前已經(jīng)開發(fā)的固定化培養(yǎng)裝置（4）中空纖維培養(yǎng)器（1）固定化培養(yǎng)法的定義將細胞限制或者定位于特定的空間位置的技術(shù)稱為細胞固定化培養(yǎng)法。固定化培養(yǎng)有優(yōu)點有：

A、細胞可維持在較小體積的培養(yǎng)液中生長。

B、對細胞的損傷程度較低。

C、易于更換培養(yǎng)液。

D、細胞和培養(yǎng)液容易分離。

E、培養(yǎng)液中產(chǎn)物濃度高。（2）動物細胞的固定化培養(yǎng)方法吸附法----所用載體有陶瓷顆粒、玻璃珠、硅膠顆粒、中空纖維膜、中空纖維培養(yǎng)器。包埋法----將細胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原、血纖維等海綿狀基質(zhì)之中。

（3）目前已經(jīng)開發(fā)的固定化培養(yǎng)裝置多層平板裝置螺旋卷膜培養(yǎng)器多層托盤式培養(yǎng)器卷帶式培養(yǎng)器中空纖維膜流化床式培養(yǎng)器中空纖維培養(yǎng)器（下面以此作為主要講解內(nèi)容）（4）中空纖維培養(yǎng)器[A]、結(jié)構(gòu)----中空纖維培養(yǎng)器屬于填充床式反應器，由培養(yǎng)器容器+供氧器+輸液泵所組成，各部份之間由硅橡膠管連接成循環(huán)回路。[B]、原理：中空纖維培養(yǎng)器由中空纖維管所組成，其管壁是半透性的多孔膜，O2和CO2的進出通道位于纖維管內(nèi)，它們能夠自由透過膜進入反應器。培養(yǎng)液通路在纖維膜外表面與反應器內(nèi)表面之間，大分子物質(zhì)不能夠自由透過纖維管壁。動物細胞則是貼附在中空纖維膜的外壁生長。（4）中空纖維培養(yǎng)器由于該裝置內(nèi)可裝有上千根中空纖維管。因此其表面積可達到其容積的40倍，溶氧的傳輸速率也可達到0.6mmol/L*H，這種結(jié)構(gòu)為大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞提供了條件。[C]、操作過程----先將細胞接種于中空纖維外表面與反應器內(nèi)表面之間。保溫的培養(yǎng)液通過輸液泵進入反應器。使細胞在流動著的培養(yǎng)基中生長。[D]、優(yōu)點[D]、優(yōu)點細胞生長密度高，可達108個/ml以上。細胞處于接近生理狀態(tài)的理化梯度之中。營養(yǎng)物質(zhì)可以有效地分布，代謝產(chǎn)物能夠及時排出。細胞培養(yǎng)可達數(shù)月，易于實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。細胞分泌的蛋白質(zhì)濃度高。產(chǎn)品純度可高達60-90%。反應器體積較小?？膳囵B(yǎng)多種細胞，有利于降低成本。3、微載體培養(yǎng)法（1）定義----將細胞吸附于微載體表面，再在培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，使細胞在微載體表面生長成單層的方法稱為微載體培養(yǎng)法。（2）微載體培養(yǎng)法的優(yōu)點:兼有固定化培養(yǎng)和懸浮細胞培養(yǎng)的雙重特點。在不增加培養(yǎng)罐體積的條件下就能增加動物細胞產(chǎn)量。便于對高水平系統(tǒng)進行檢測與控制。（3）微載體培養(yǎng)法所用的材料（4）Cytodex-1微載體培養(yǎng)法的技術(shù)指標（3）微載體培養(yǎng)法所用的材料對細胞無毒、容易使細胞產(chǎn)生貼附，其密度大于1，微粒的直徑為100-200um，可容納幾百個細胞。目前已經(jīng)選用的材料有：

DEAE-Sephadex-A50 DEAE-Sephadex-A52

QAE-Sephadex 經(jīng)處理的塑料尼龍 二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺

聚苯乙烯市場上出售的商品微粒有：

DEAE-交聯(lián)葡聚糖（Cytodex-1，Superbeads）

二甲基氨基丙基聚丙烯酰胺（Biocarrier）

聚苯乙烯（Biosilon）（4）Cytodex-1微載體培養(yǎng)法的技術(shù)指標干顆粒直徑60-87um、在培養(yǎng)液中可膨脹成160-230um，每克微粒的表面積為0.6平方米，相當于7個標準轉(zhuǎn)瓶（直徑285mm*長度110mm）、采用培養(yǎng)罐進行培養(yǎng)。Cytodex-1的濃度為1mg/ml。相當于8000-9000粒/ml。其表面積為10cm2。細胞生長密度可達105個/ml。培養(yǎng)前24小時，將細胞貼附于載體上。培養(yǎng)液、葡萄糖、細胞同時加入培養(yǎng)罐中。（4）Cytodex-1微載體培養(yǎng)法的技術(shù)指標溫度為37℃PH=7.2-7.3溶解氧為20%攪拌速度為60-75轉(zhuǎn)/分鐘。（三）動物細胞工程制藥基本過程1.生產(chǎn)用動物細胞的獲得：要求；獲得；2、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)；貼壁培養(yǎng)；固定化培養(yǎng)3、培養(yǎng)的操作方式分批式培養(yǎng)、流加式培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)（三）動物細胞工程制藥基本過程4、培養(yǎng)過程的調(diào)控細胞生長檢測：細胞計數(shù)、細胞常規(guī)檢查、微生物污染影響細胞培養(yǎng)的理化因素及其檢測：溫度、pH、溶氧的檢測與控制、攪拌、葡萄糖和乳酸、氨、甲基乙二醛（以胎牛血清來降低其濃度）八、動物細胞工程的實例1、組織纖溶酶原激活劑（t-PA）生產(chǎn)工藝2、抗HbsAg的單克隆抗體生產(chǎn)工藝（略）

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)在制藥中的應用作為反應器用于制藥：如t-PA、EPO、凝血因子ⅧⅨ、干擾素、生長激素2.作為宿主細胞用于制藥：病毒利用培養(yǎng)的細胞復制和具有無限增殖潛力的細胞系推動了疫苗的生產(chǎn)3.制備雜交瘤細胞，生產(chǎn)單克隆抗體：甲肝病毒單克隆抗體、抗人IgM單克隆抗體4、本身作為產(chǎn)品：人造器官、組織工程皮膚、胰島細胞、腦細胞、腎細胞的移植、羊水穿刺5、藥學研究細胞體外測試系統(tǒng)研究藥物的藥理、毒理和作用機制1、組織纖溶酶原激活劑（t-PA）生產(chǎn)工藝組織纖溶酶原激活劑是一種絲氨酸蛋白酶，它可使組織纖溶酶原活化成纖溶酶，而纖溶酶可水解纖維蛋白，因此組織纖溶酶原激活劑對血栓具有治療作用。培養(yǎng)基---Eagle培養(yǎng)基，加入青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml、10%小牛血清。

人纖溶酶原（Plasminogen,Plg）經(jīng)纖溶酶原激活劑（PA）激活，轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶（Plm），不僅能發(fā)揮纖溶作用，溶解血栓，而且參與體內(nèi)一系列與蛋白質(zhì)水解有關(guān)的生理、病理過程，如炎癥、組織重建、排卵、腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移，對它的研究可為研制新型溶栓、抗炎、抗腫瘤藥物提供新思路**tPA進入血漿后與纖溶酶原激活劑抑制物形成復合物，迅速失去活性，肝細胞膜上也有tPA特異性受體，可快速與tPA結(jié)合，降低其半衰期，因此治療劑量很高，同時海馬回等腦組織含有豐富tPA受體，所以用于溶栓治療時，顱腔出血的發(fā)生率比其他溶栓藥物高纖溶酶的底物專一性很差，水解纖維蛋白原、Ⅴ因子、Ⅷ因子，如果不加控制，將會增加出血的危險，如果有血漿蛋白α2-AP，它就可以中和纖溶酶，還可以緩慢降解凝血塊表面的纖溶酶（1）t-PA抗體的制備（2）抗t-PA的親和吸附劑的制備

[A]、Sepharose4B的活化

[B]、抗t-PA親和吸附劑（t-PA-IgG-Sepharoes-4B親和吸附劑）的制備（3）細胞培養(yǎng)（4）t-PA的分離（5）t-PA的精制（1）t-PA抗體的制備取人t-PA、或者豬心t-PA

→按每只家兔200-300ug的計量，t-PA采用福氏完全佐劑充分乳化，注射入家兔皮下。

→每隔2周再用t-PA100ug進行加強免疫，共加強2次

→取家兔血清

→用50%硫酸銨鹽析

→沉淀物于0℃下，用生理鹽水透析

→經(jīng)過Sephadex75柱層析

→得到抗t-PA的免疫球蛋白IgG備用（2）抗t-PA的親和吸附劑的制備[A]、Sepharose4B的活化[B]、抗t-PA的親和吸附劑（t-PA-IgG-Sepharoes-4B親和吸附劑）的制備

[A]、Sepharose4B的活化Sepharose4B用10倍體積的蒸餾水（V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽濾

→取20克Sepharose4B濕凝膠放入500ml的三頸燒瓶中，加蒸餾水30ml，攪均勻后，用2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH=11，降溫至18℃

→在通風櫥中，另取溴化氰1.5g于乳缽中，加入30-40ml蒸餾水分多次研磨溶解

→將溴化氰溶液倒入三頸燒瓶中，升溫至20-22℃，同時滴加2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH=11-12

→等反應液PH值不變時，繼續(xù)反應5分鐘，取出燒瓶，向其中投入小冰塊降溫，用3號垂熔漏斗抽濾[A]、Sepharose4B的活化

→用300ml、4℃、0.1mol/L的NaHCO3溶液洗滌。然后用300ml、PH=10.2、0.025mol/L的硼酸緩沖液分3-4次抽濾洗滌

↓

最后轉(zhuǎn)移至250ml的燒瓶中，加入50-60ml的硼酸緩沖液，即得活化的Sepharose4B，備用[B]、抗t-PA的親和吸附劑（t-PA-IgG-Sepharoes-4B親和吸附劑）的制備取步驟-2中的抗t-PA的免疫球蛋白IgG，70-80mg溶于20ml硼酸緩沖液中、過濾。濾液加入到已經(jīng)活化的Sepharose4B中，10℃下攪拌反應16-18小時

→第二天裝柱，用10倍柱床體積（V/V）、PH=10.2的硼酸緩沖液，以5-6ml/min的流速洗滌柱床。收集流出液，測定其A280

→用5倍柱床體積（V/V）的、PH=10.0、0.1mol/L乙醇胺溶液洗滌柱床

→用5倍柱床體積（V/V）的、PH=8.0、0.1mol/L硼酸緩沖液洗滌柱床[B]、抗t-PA的親和吸附劑（t-PA-IgG-Sepharoes-4B親和吸附劑）的制備

→用5倍柱床體積（V/V）的、PH=7.4、0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌平衡。

→直到流出液的A280小于0.01，所得到的固定化抗t-PA的免疫球蛋白IgG，就是待提取的t-PA的親和吸附劑。

→將其轉(zhuǎn)移至含0.01%NaN3的、PH=7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖液中，于4℃下貯存，備用（3）細胞培養(yǎng)取5L玻璃轉(zhuǎn)瓶，按每平方米表面積2.5L的比例加入細胞培養(yǎng)液。

→將人黑色素瘤細胞按常規(guī)方法消化分散、洗滌、計數(shù)、稀釋成細胞懸液。

→將細胞懸浮液接種到轉(zhuǎn)瓶之中，接種濃度為103—3*103個/ml

→置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃下培養(yǎng)、通入含5%CO2的無菌空氣

→等到長成致密單層之后，棄去培養(yǎng)液，

用PH=7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖液洗滌細胞單層2-3次。（3）細胞培養(yǎng)→換入無血清Eagle培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)

→每隔3-4天收獲一次培養(yǎng)液，用于制備t-PA。

同時向轉(zhuǎn)瓶中加入新鮮無血清Eagle培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)

→如此反復，可獲得大量t-PA。（4）t-PA的分離步驟-4中所收集到的培養(yǎng)液中，加入蛋白酶抑制劑aprotinin至5萬單位/ml。加吐溫-80至于0.01%、過濾、除去沉淀.濾液稀釋3倍

→稀釋液上柱，以5ml/min的流速進入t-PA-IgG-Sepharoes-4B親和柱（直徑4cm*長度40cm）。

→用含0.01%的吐溫-80+2.5萬單位/ml的蛋白酶抑制劑aprotinin+0.25mol/L的KSCN的PH=7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖液以同樣的流速洗滌親和柱，以除去雜蛋白（4）t-PA的分離→最后用3mol/L的KSCN溶液洗脫親和柱，

以每管10-15ml的體積進行分區(qū)收集

合并t-PA的洗脫峰，

→裝入透析袋內(nèi)，埋入到PEG20000中濃縮至原體積的1/10-1/5。

→各t-PA粗提物（5）t-PA的精制t-PA粗提物

→進Sephadex-G-150柱（直徑2cm*長度100cm）

→用含0.01%的吐溫-80的1mol/L的NH4HCO3溶液以2-3ml/min的流速進行洗脫

→以每管10-15ml的體積進行分區(qū)收集

合并t-PA的洗脫峰，

→于凍干機中進行凍干

→得t-PA精品抗HbsAg的單克隆抗體生產(chǎn)工藝簡要步驟一、培養(yǎng)基1、大鼠骨髓瘤IR983F細胞系的培養(yǎng)基為Dulbecoo`sEagle培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基）2、雜交瘤細胞篩選系統(tǒng)的培養(yǎng)基用含HAT的DMEM培養(yǎng)基二、飼養(yǎng)細胞的制備----大鼠腹腔巨噬細胞的培養(yǎng)三、親本細胞的制備1、大鼠骨髓瘤IR983F細胞親本的制備2、受HbsAg免疫的大鼠脾淋巴細胞親本的制四、抗（HbsAg）的單克隆抗體-親和吸附劑（HbsAg-McAb-Sepharose-4B）的制備抗HbsAg的單克隆抗體生產(chǎn)工藝簡要步驟五、細胞融合六、雜交瘤細胞的篩選七、抗（HbsAg）的單克隆抗體（McAb）的動物活體反應器生產(chǎn)八、抗（HbsAg）的單克隆抗體（McAb）的分離和純化雜交瘤技術(shù)的基本過程骨髓瘤細胞免疫小鼠取出脾臟3d單細胞懸浮PEG細胞融合HAT培養(yǎng)基37℃，5%CO2篩選抗體株克隆陽性細胞,1細胞/孔增殖陽性克隆腹水制備中空纖維反應器擴大培養(yǎng)凍存細胞-70℃或液氮第三節(jié)、植物細胞工程一、植物細胞培養(yǎng)概況二、植物細胞培養(yǎng)的基本概念三、植物細胞培養(yǎng)的技術(shù)流程四、植物細胞工程的應用五、植物細胞培養(yǎng)的實例一、植物細胞培養(yǎng)概況1、可供培養(yǎng)的植物種類（1）到目前為止，有研究顯示，近300種植物的細胞培養(yǎng)物能夠產(chǎn)生400多種有效的藥用成份。（2）許多藥用植物如人參、長春花、紫草、甘草、紫杉、銀杏、黃連等，其細胞培養(yǎng)十分成功。（3）據(jù)初步統(tǒng)計，有約30種化合物在培養(yǎng)細胞中的含量已經(jīng)超過1%，如紫草素的含量可達12%、小檗堿的含量可達1%，人參皂苷可達7%。一、植物細胞培養(yǎng)概況2、目前現(xiàn)存的問題（1）技術(shù)工藝還不夠成熟。（2）提高單位培養(yǎng)基中有效物質(zhì)的產(chǎn)量（3）降低目的產(chǎn)物的生產(chǎn)成本（4）改進培養(yǎng)條件（5）篩選高產(chǎn)細胞株（6）研制適合于植物細胞培養(yǎng)的新型反應器二、植物細胞培養(yǎng)的基本概念1、植物細胞培養(yǎng)的定義----植物組織和細胞培養(yǎng)是指在無菌條件、人工控制的營養(yǎng)和培養(yǎng)基、人工控制的環(huán)境條件如光照、溫度下，研究植物的細胞、組織、器官，以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。它是對細胞進行遺傳操作及細胞保藏的基礎(chǔ)，針對植物的培養(yǎng)主要有植物組織培養(yǎng)、植物細胞培養(yǎng)、花藥及花粉培養(yǎng)、離體胚培養(yǎng)以及原生質(zhì)體培養(yǎng)這幾個大類2、植物細胞培養(yǎng)的類別----13大類3、次級代謝產(chǎn)物和植物細胞的培養(yǎng)特性2、植物細胞培養(yǎng)的類別（1-6）（1）植物培養(yǎng)----幼苗和較大植株的培養(yǎng)稱為植物培養(yǎng)。（2）愈傷組織培養(yǎng)----從植物體各種器官的外植體通過增殖而形成的愈傷組織，并對其進行培養(yǎng)的方法，稱為愈傷組織培養(yǎng)。（3）懸浮培養(yǎng)----能夠保持較好分散性的離體細胞、或者是較小的細胞團的液體進行培養(yǎng)的技術(shù)稱為懸浮培養(yǎng)。在此培養(yǎng)條件下獲得的細胞組織化程度較低。（4）器官培養(yǎng)----離體器官如莖尖、根尖、葉片、花器官各部分原基、未成熟的花器官各部分、未成熟的果實的培養(yǎng)，稱為器官培養(yǎng)。（5）胚胎培養(yǎng)----對于未成熟或者成熟的胚胎進行離體培養(yǎng)的方式，稱為胚胎培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，如果小植株的發(fā)生途徑與正常的受精卵發(fā)育方式相同，這一過程就稱為“胚胎形成”。如果在體細胞或者花藥的培養(yǎng)中，培養(yǎng)物是小孢子這樣的單倍體細胞，則它所形成的結(jié)構(gòu)就稱為“胚狀體或不定胚”。（6）細胞培養(yǎng)----是指利用單個細胞進行液體或者固體培養(yǎng)，并誘導其增殖、分化，其目的是為了得到單細胞無性繁殖系。2、植物細胞培養(yǎng)的類別（7-13）（7）分生組織培養(yǎng)----又稱生長錐培養(yǎng)，是指在人工培養(yǎng)基中培養(yǎng)莖端分生組織。莖端分生組織僅僅位于莖尖頂端的園錐區(qū)，其長度小于0.1mm。（8）外植體培養(yǎng)---外植體是指植物組織器官的切段，如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉進行培養(yǎng)稱為外植體培養(yǎng)。（9）器官形成---是指在組織培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)基中，植物芽、根、花等器官的形成一分化。首先形成小根基，然后在其基部迅速形成愈傷組織，然后再形成芽、最后形成小植株的過程。（10）無性繁殖系---又叫克隆，是指通過對培養(yǎng)物進行反復的繼代培養(yǎng)，利用同種外植體來獲得越來越多的無性繁殖系。如根無性系、組織無性系、懸浮培養(yǎng)物無性系。（11）突變體---細胞本身由于變異、或者是通過應用誘變技術(shù)進行處理，所獲得的遺傳變異性新細胞，稱為突變體。（12）原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)---由外植體上切下來的組織細胞的第一代培養(yǎng)稱為“原代培養(yǎng)”、從此以后的多代培養(yǎng)則稱為“繼代培養(yǎng)”（13）連續(xù)培養(yǎng)---是指在培養(yǎng)罐中不斷地加入新的培養(yǎng)基、并且連續(xù)收集培養(yǎng)物，以保持反應平衡而進行的長期不轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)方式。3、次級代謝產(chǎn)物和植物細胞的培養(yǎng)特性1、植物體內(nèi)次級代謝產(chǎn)物具有以下特征：（1）有明顯的分類學區(qū)域界限，（2）其合成需要在一定條件下才能進行，（3）缺乏明顯的生理功能，（4）是生命過程的多余成份。如生物堿、黃酮類、萜類、有機酸、木質(zhì)素。2、植物細胞的培養(yǎng)特性：（1）植物細胞較微生物細胞大得多，具有纖維素細胞壁。（2）培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染、需要用抗生素。（3）在細胞生長的中期和對數(shù)期，容易凝聚成直徑達350-400um的團塊，懸浮培養(yǎng)比較困難。（4）培養(yǎng)時需要供氧，培養(yǎng)液粘度較大，不能耐受強力通風攪拌。（5）細胞具有群體效應、無錨地依賴性和接觸抑制性。（6）細胞培養(yǎng)產(chǎn)物多數(shù)滯留于細胞內(nèi)，產(chǎn)量較低。（7）培養(yǎng)過程中保持結(jié)構(gòu)、功能上的全能性。三、植物細胞培養(yǎng)的技術(shù)流程（一）植物材料的準備和處理（二）培養(yǎng)基（三）培養(yǎng)方法（四）植物細胞種質(zhì)保存技術(shù)（五）植物細胞突變體篩選技術(shù)（六）植物原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)（七）植物細胞融合技術(shù)（八）影響植物次級代謝產(chǎn)物積累的諸因素分析（一）植物材料的準備和處理用于植物組織培養(yǎng)的外植體，必須是無菌材料。在培養(yǎng)之前必須對外植體進行嚴格的滅菌處理。植物不同的組織，所需要的滅菌步驟也各不相同

1、常用的滅菌試劑2、滅菌步驟1、常用的滅菌試劑次氯酸鈣 9-10% 5-30分鐘

次氯酸鈉 0.5-5% 5-30分鐘

過氧化氫 3-12% 5-15分鐘

溴水 1-2% 2-10分鐘

硝酸銀 1% 5-30分鐘

氯化汞 0.1-1% 2-10分鐘

抗生素 4-50mg/L 30-60分鐘

最常用的是----次氯酸鈉、次氯酸鈣、氯化汞。（1）種子滅菌前處理----純酒精中浸泡10分鐘，再用無菌水漂洗。滅菌----100g/L次氯酸鈣浸泡20-30min，再用10g/L溴水浸泡5min。滅菌后處理----無菌水洗3次，然后在無菌水中發(fā)芽。（2）果實和莖切段滅菌前處理----純酒精漂洗滅菌----20g/L次氯酸鈉浸泡10min滅菌后處理----無菌水反復沖洗3次，然后再剖開內(nèi)部種子。2.滅菌步驟

2.滅菌步驟

（3）儲藏器官和葉片滅菌前處理----自來水洗凈滅菌----20g/L次氯酸鈉浸泡20-30min滅菌后處理----無菌水反復沖洗3次、濾紙吸干。（二）培養(yǎng)基1、植物細胞的營養(yǎng)需求2、培養(yǎng)基的組成成份3、培養(yǎng)基的配制原則和常見的培養(yǎng)基類型1、植物細胞的營養(yǎng)需求（1）無機營養(yǎng)物---N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo（2）維生素---維生素B1、B6，煙酸、肌醇、生物素、泛酸鈣、葉酸。（3）碳源---蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、山梨醇。（4）天然物---水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取物、香蕉汁、荸薺汁、蘋果汁。（5）氨基酸類---甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、賴氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、組氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、天冬酰氨、酪氨酸、精氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、胸腺嘧啶。（6）核酸及其水解物---DNA、RNA、黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶。（7）植物激素：生長素類---吲哚-3-乙酸（LLA）、赤霉素（GA3）細胞分裂素類---6-芐氨基嘌呤（6-BA）、脫落酸（ABA）、乙烯萘乙酸（NAA）、2、4-D、吲哚乙酸。其它激素類---長蠕孢醇、核盤菌素、油菜素內(nèi)酯、三十烷醇、肽類、半支蓮醇、月光花素、石蒜素、玉米素、向日葵素、精子囊素。（8）其它成份---氯化膽堿、膽質(zhì)素、蘋果酸、反丁烯二酸、固形劑、瓊脂。2、培養(yǎng)基的組成成份AlCl3 CaCl2*2H2O Ca（NO3）2*4H2OCoCl3*6H2O CuSO4*5H2O FeCl3*6H2O Fe2（SO4）3 FeSO4*7H2O H3BO3 KCl KH2PO4 KI KNO3MgSO4*7H20 MnSO4*H2O MnSO4*4H2O NaH2PO4 NaH2PO4*H2ONaH2PO4*2H2O NaNO3 Na2EDTA Na2EDTA*2H2O Na2MoO4*2H2O Na2SO4 NH4NO3 （NH4）2SO4NiCl2*6H2O ZnSO4*7H20 肌醇煙堿酸 泛酸 鹽酸吡咯醇核黃素 鹽酸硫胺素 3、培養(yǎng)基的配制原則和常見的培養(yǎng)基類型（1）培養(yǎng)基的配制原則母液配制時各成份濃度應該比實際使用濃度擴大一定倍數(shù)，使用時稀釋。培養(yǎng)液應該維持PH值恒定，常用1mol/L的HCl、或者1mol/L的NaOH進行調(diào)節(jié)。培養(yǎng)基分裝之后，外加棉花塞和牛皮紙包扎，在82.74--1030.42kPa壓力下、121℃下、消毒滅菌20min、冷卻之后就可以用于接種。3、培養(yǎng)基的配制原則和常見的培養(yǎng)基類型（2）常見的培養(yǎng)基類型Gamborg`sb5培養(yǎng)基 Heller`ssalts培養(yǎng)基Linsmaier-Bednar&Skoog培養(yǎng)基 Murashige&Skoog培養(yǎng)基（MS）Nitsh`sH培養(yǎng)基 Schenk-Hildebrandt培養(yǎng)基Takebe培養(yǎng)基 White`s-3salts培養(yǎng)基（三）培養(yǎng)方法1、固體培養(yǎng)體系2、液體培養(yǎng)體系3、大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)方法1、固體培養(yǎng)體系（1）定義---固體培養(yǎng)體系包括利用瓊脂作為支持物的固體培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)技術(shù)。是指在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)過加熱溶解—裝瓶—冷卻—凝固之后形成固體培養(yǎng)基。（2）常用的固化劑瓊脂 藻酸鹽 角叉藻聚糖 明膠 羥乙基纖維素 聚丙烯酰胺淀粉 硅膠（3）優(yōu)點---簡便易行、所占空間較小。（4）缺點：外植體或愈傷組織只有一部分與培養(yǎng)基發(fā)生接觸，接觸部位的營養(yǎng)物質(zhì)可被迅速吸收，從而形成培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度差，結(jié)果導致愈傷組織的生長不平衡。由于外植體的基部插入到固體培養(yǎng)基中，使得此外呈現(xiàn)出氣體交換不暢的狀態(tài)，阻礙了組織呼吸作用的正常進行，同時也會大量堆積生長過程中積累的有害物質(zhì)。由于重力作用，以及光線從上部或者一側(cè)射入，常常導致愈傷組織細胞間出現(xiàn)極化現(xiàn)象，結(jié)果導致細胞細胞群體的不均勻。當固體培養(yǎng)出的植株轉(zhuǎn)入液體環(huán)境時，常常導致組織很快膨脹。2、液體培養(yǎng)體系（1）懸浮培養(yǎng)法（2）平板培養(yǎng)法（3）微室培養(yǎng)法（4）看護培養(yǎng)法（1）懸浮培養(yǎng)法定義----游離的植物細胞懸浮于液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法稱為懸浮培養(yǎng)法?；静襟E----將愈傷組織、無菌苗、吸漲的胚胎、外植體尖芽、根尖、葉肉組織，經(jīng)勻漿器械掏碎，紗布或者不銹鋼網(wǎng)過濾，提到的單細胞濾液作為接種材料，接種于試管或者培養(yǎng)皿中進行振蕩培養(yǎng)。特點----其培養(yǎng)過程能夠嚴格地出現(xiàn)重復的周期性變化，所培養(yǎng)的細胞具有典型的指數(shù)增長規(guī)律，分別有延遲期、對數(shù)生長期、減慢生長期、靜止期。需要進行不斷的繼代培養(yǎng)。（2）平板培養(yǎng)法定義----分散的植物細胞接種于含薄層固體培養(yǎng)基器皿內(nèi)進行培養(yǎng)的過程稱為平板培養(yǎng)方法?；静襟E----將消化分散后的細胞在除去消化液之后，經(jīng)過濃縮和計數(shù)，再接種到35℃左右的固體培養(yǎng)基之中，于25℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱之中進行培養(yǎng)，細胞即可生長成團。（3）微室培養(yǎng)法定義----懸浮的單細胞接種于由玻璃環(huán)和蓋玻片所構(gòu)成的微室之中的固體培養(yǎng)基中，進行培養(yǎng)的方法?；静襟E----在微室內(nèi)預置瓊脂培養(yǎng)基，然后接種細胞懸浮液，再蓋上蓋玻片，然后在蓋玻片的外沿用石蠟或者凡士林進行密封，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，維持溫度26-28℃，細胞即可生長。優(yōu)點----能夠直接觀察細胞分裂和組織分化的全過程，同時可以進行顯微鏡攝像。（4）看護培養(yǎng)法基本步驟----在三角燒瓶中加入固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基上放置一塊直徑為幾毫米的愈傷組織，再地組織塊上放置一張經(jīng)過滅菌的濾紙，次日在濾紙上就會吸收由組織塊中滲出的培養(yǎng)基成份，最后將細胞接種于濾紙上面，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，維持溫度26-28℃，細胞即可生長。優(yōu)點----操作簡便，能夠為單細胞生長提供良好的環(huán)境。缺點----培養(yǎng)時間較長，不能直接進行觀察3、大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)方法（1）成批培養(yǎng)法（2）半連續(xù)培養(yǎng)法（3）連續(xù)培養(yǎng)法（4）固定化培養(yǎng)法（1）成批培養(yǎng)法定義----將培養(yǎng)基一次性地加入到反應器之中、接種、培養(yǎng)一定時間之后，收獲細胞的操作方法。實例----1953年Tulecke設計了一個20L的培養(yǎng)瓶，并利用這個系統(tǒng)培養(yǎng)了銀杏、冬青、黑麥草、薔薇等植物細胞。日本人發(fā)明了二步培養(yǎng)法，第一步用于細胞數(shù)量的增殖，第二步則用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，成功生產(chǎn)出第一個植物細胞工程產(chǎn)品----紫草素。（2）半連續(xù)培養(yǎng)法[A]、定義----