常用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 傳代1原代培養(yǎng)細(xì)胞的首次傳代

2023/10/271原代培養(yǎng)細(xì)胞首次傳代

2023/10/2722023/10/27一、原代培養(yǎng)細(xì)胞的首次傳代懸浮細(xì)胞：增殖，數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度；貼壁細(xì)胞：相互匯合，覆蓋整個(gè)瓶底；=〉細(xì)胞難以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)使細(xì)胞分散接種的過(guò)程稱(chēng)之為傳代。傳代原因：1、細(xì)胞與培養(yǎng)基的接觸面減少，造成營(yíng)養(yǎng)不足；2、生長(zhǎng)的密度抑制。2023/10/2732023/10/2742023/10/27貼壁細(xì)胞的消化傳代步驟(1)吸除舊培養(yǎng)基(2)加2mLPBS（無(wú)鈣、鎂），漂洗一次(3)加1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）(4)輕搖培養(yǎng)瓶，消化液鋪滿(mǎn)細(xì)胞表面2023/10/2752023/10/27(4)

鏡下見(jiàn)細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，倒掉消化液，再繼續(xù)作用2～3分鐘。(5)鏡下見(jiàn)變圓，立即終止消化。(6)加完全培養(yǎng)基，反復(fù)吹打；吹打按順序進(jìn)行，確保所有瓶壁均吹到吹打要輕柔，不要出現(xiàn)泡沫，避免機(jī)械損傷(7)

計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度，分瓶培養(yǎng)。2023/10/2762023/10/27首次傳代應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：(1)密度不高，不能傳代，〉80%(2)控制消化時(shí)間。多種細(xì)胞混雜，不同細(xì)胞消化時(shí)間不同。(3)吹打輕，減少機(jī)械損傷。(4)接種量多一些，使盡快適應(yīng)環(huán)境，生長(zhǎng)和繁殖。(5)pH應(yīng)偏低些，血清濃度加大至15%～20%。2023/10/2772023/10/27125二、細(xì)胞系的維持細(xì)胞系的維持通過(guò)換液、傳代、再換液、再傳代和細(xì)胞凍存實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞系的維持要注意以下幾點(diǎn)：每個(gè)細(xì)胞系做好檔案，包括組織來(lái)源、生物學(xué)特性、培養(yǎng)特點(diǎn)（培養(yǎng)液、換液、傳代時(shí)間……)、生長(zhǎng)形態(tài)、遺傳學(xué)特點(diǎn)……。換液、傳代按自身規(guī)律進(jìn)行。防止細(xì)胞系間交叉污染。細(xì)胞系傳代次數(shù)較少時(shí)，做好充足凍存貯備。做好細(xì)胞系（或株）的鑒定和管理工作。2023/10/2782023/10/2792023/10/27三、原代細(xì)胞的純化和克隆原代細(xì)胞絕大多數(shù)混合生長(zhǎng)為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性；采用單一種類(lèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；因而純化就成為實(shí)驗(yàn)研究的重要一步。2023/10/27102023/10/27純化方法(一)自然純化：傳代過(guò)程中自然淘汰法生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)旺排擠生長(zhǎng)慢的細(xì)胞最后留下優(yōu)勢(shì)旺細(xì)胞。如腫瘤突變細(xì)胞通過(guò)此方法建立細(xì)胞系。缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)；最后剩下的不一定是所需細(xì)胞，通常是成纖維細(xì)胞，少部分是惡性腫瘤細(xì)胞。(二)人工純化：利用人為手段造成有利某一細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，抑制其他細(xì)胞生長(zhǎng)。主要有以下5種方法：2023/10/27112023/10/271.培養(yǎng)基限定法：細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，必須存在或去除某種物質(zhì)，否則無(wú)法生長(zhǎng)，而其他細(xì)胞與之相反。例如加入特殊的細(xì)胞因子而純化出只依賴(lài)于這種細(xì)胞因子生長(zhǎng)的細(xì)胞系。2.酶消化法：上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性高；成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的敏感---耐受性低；使兩者分開(kāi)，達(dá)到純化的目的。2023/10/27122023/10/273.機(jī)械刮除法原代培養(yǎng)時(shí)，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片生長(zhǎng)，機(jī)械方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域。方法：顯微鏡下，用專(zhuān)用細(xì)胞刮刮掉，沖洗2次后，繼續(xù)培養(yǎng)。多次后達(dá)純化目的。2023/10/27132023/10/274.反復(fù)貼壁法成纖維細(xì)胞：貼壁快（10-30min）；上皮細(xì)胞：短時(shí)間不能附著或附著不穩(wěn)定，稍振蕩即浮起據(jù)此純化細(xì)胞。方法：鏡下觀察，部分細(xì)胞貼壁后搖蕩培養(yǎng)基，倒掉反復(fù)多次，達(dá)到去除上皮細(xì)胞的目的。2023/10/27142023/10/275.克隆法稀釋細(xì)胞，使單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，形成的細(xì)胞群稱(chēng)作克隆。每個(gè)克隆含50個(gè)以上細(xì)胞，一個(gè)克隆起源一個(gè)細(xì)胞，達(dá)到純化目的。使細(xì)胞遺傳學(xué)和生物學(xué)特性更相似，利于實(shí)驗(yàn)研究。6.流式細(xì)胞儀分離法可根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)含量、結(jié)構(gòu)和大小等達(dá)到分離細(xì)胞的目的。

2023/10/27152023/10/27細(xì)胞傳代方法傳代細(xì)胞，不同細(xì)胞采取不同的傳代方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞：消化法傳代；部分貼壁的細(xì)胞：直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細(xì)胞：加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散傳代自然沉降，加入新培養(yǎng)基后再吹打分散傳代。2023/10/27162023/10/27貼壁細(xì)胞的消化傳代步驟(1)吸除舊培養(yǎng)基(2)加2mLPBS（無(wú)鈣、鎂），漂洗一次(3)加1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）(4)輕搖培養(yǎng)瓶，消化液鋪滿(mǎn)細(xì)胞表面2023/10/27172023/10/27(4)

鏡下見(jiàn)細(xì)胞回縮，