植物酵素對(duì)酒精性肝損傷小鼠的預(yù)防及治療作用

植物酵素對(duì)酒精性肝損傷小鼠的預(yù)防及治療作用

酒精的歷史很悠久。隨著現(xiàn)代社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步，飲料消費(fèi)也日益增加。過度消費(fèi)已成為全社會(huì)關(guān)注的社會(huì)安全問題。據(jù)報(bào)道,適量飲酒有益于人身體健康,但急性大量飲酒能引起惡心、嘔吐、記憶力減退、注意力不集中,嚴(yán)重時(shí)可因呼吸肌麻痹而死亡。長(zhǎng)期飲酒可導(dǎo)致酒精性肝炎、脂肪肝、肝硬化等嚴(yán)重疾病。因此美國熱銷解酒藥RU21和我國解酒藥物解酒保健茶、解酒靈、醒酒肽飲料、茶多福膠囊等解酒保肝類產(chǎn)品的面世對(duì)于酒精性飲品日益增多的今天有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。酵素類飲品風(fēng)靡于日本、臺(tái)灣等地區(qū),受到當(dāng)?shù)厝说膹V泛青睞,但是其提取工藝略有不同。本實(shí)驗(yàn)采用的植物酵素是采用傳統(tǒng)的綠色發(fā)酵工藝,不添加任何食品添加劑,從50余種新鮮的水果、蔬菜、菌類等植物中提取的酵素精華液,它含有多種營養(yǎng)成分,如低聚糖、黃酮、皂苷、多酚類物質(zhì)等,具有潤腸通便、解酒等作用。本實(shí)驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象,按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)規(guī)定及相關(guān)文獻(xiàn)研究植物酵素對(duì)酒精性肝損傷小鼠是否有預(yù)防及治療作用。1材料和方法1.1試劑與試劑盒植物酵素:吉林敖東大高酵素有限公司,批號(hào)110801;乙醇脫氫酶試劑盒、還原型谷胱甘肽試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒:南京建成生物工程研究所;TG試劑盒:浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司;陽性對(duì)照藥聯(lián)苯雙酯滴丸:北京協(xié)和藥廠,產(chǎn)品批號(hào)11090204;力克:遼寧力克制藥公司;RU21:美國進(jìn)口。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠,雄性,體重18~22g,吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK-(吉)2008-0005。飼料來源同上。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1酒精性肝損傷模型的建立和指標(biāo)的測(cè)定1.3.1.植物酵素外施液對(duì)小鼠口灌胃的影響小鼠按體重,隨機(jī)分為模型對(duì)照組、空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組和低、中、高劑量組,每組10只。其中低、中、高3個(gè)劑量組經(jīng)小鼠口灌胃給予植物酵素劑量分別為10、20、30mL/kgBW,模型對(duì)照組和空白對(duì)照組給予蒸餾水的劑量為20mL/kgBW,陽性對(duì)照組給予聯(lián)苯雙酯23mL/kgBW。動(dòng)物3d稱重一次,按照體重調(diào)整受試樣品劑量,連續(xù)灌胃30d。1.3.1.肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)受試樣品結(jié)束時(shí)將模型對(duì)照組及各樣品組一次灌胃,給予50%乙醇14mL/kgBW,空白對(duì)照組給蒸餾水,禁食16h處死動(dòng)物,取肝臟組織進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)及病理組織學(xué)檢查。用于檢測(cè)指標(biāo)的樣本前處理:準(zhǔn)確稱取待測(cè)組織的質(zhì)量,加生理鹽水制成10%的組織勻漿,3000r/min離心10min。然后取組織勻漿上清液,加入生理鹽水,稀釋成1%組織勻漿,待測(cè)。操作過程見各實(shí)驗(yàn)試劑盒使用說明。1.3.2預(yù)防和處理植物酶1.3.2.灌酒時(shí)效試驗(yàn)取40只雄性昆明種小鼠,隨機(jī)分成模型組、實(shí)驗(yàn)組、陽性藥物Ⅰ組、陽性藥物Ⅱ組,每組10只。4組小鼠先禁食12h,自由飲水再進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)處理:實(shí)驗(yàn)組灌胃植物酵素0.2mL/10gBW;模型組灌胃生理鹽水0.2mL/10gBW,陽性藥物Ⅰ組灌胃力克0.2mL/10gBW,陽性藥物Ⅱ組灌胃RU21284.2mg/10gBW。給藥30min后各組分別灌胃50°白酒0.165mL/10gBW。灌酒后記錄各組小鼠醉酒數(shù)、死亡數(shù)、醉酒耐受時(shí)間(從灌完酒到翻正反射消失時(shí)間)和醒酒時(shí)間(從翻正反射消失到恢復(fù)所需的時(shí)間)。小鼠醉酒與否以翻正反射是否消失為標(biāo)準(zhǔn):小鼠灌酒后將其背向下輕輕放入動(dòng)物籠,若動(dòng)物背向下的姿勢(shì)保持30s以上,則認(rèn)為翻正反射消失,即為醉酒。1.3.2.植物酵素飲料的配制取40只雄性昆明種小鼠,隨機(jī)分成模型組、實(shí)驗(yàn)組、陽性藥物Ⅰ組、陽性藥物Ⅱ組,每組10只。4組小鼠先禁食12h,自由飲水,先灌胃50°白酒0.165mL/10gBW,再進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)處理:實(shí)驗(yàn)組灌胃植物酵素0.2mL/10gBW,模型組灌胃生理鹽水0.2mL/10gBW,陽性藥物Ⅰ組灌胃力克0.2mL/10gBW,陽性藥物Ⅱ組灌胃RU21284.2mg/10gBW。灌藥后記錄各組小鼠醉酒數(shù)、死亡數(shù)、醉酒耐受時(shí)間和醒酒時(shí)間。1.3.3酒精性肝損傷依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)酒精性肝損傷檢驗(yàn)方法及文獻(xiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。各組數(shù)據(jù)用ue0af±s表示,P<0.05為差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果與分析2.1小鼠體重的變化由表1可見:喂養(yǎng)前,動(dòng)物隨機(jī)分組,各劑量組間的小鼠體重沒有顯著性差異;喂養(yǎng)30d后,給予酵素的劑量組的體重與模型組比較有差異性,可能是酵素中糖類物質(zhì)使小鼠有飽腹感,進(jìn)而進(jìn)食量減少,體重減輕。2.2肝谷草轉(zhuǎn)氨酶got和谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶pgt的活力結(jié)果和分析2.2.1標(biāo)準(zhǔn)got曲線2.2.2標(biāo)準(zhǔn)的pgt曲線2.2.3肝臟組織損害由表4可見:與正常組比較,模型組GOT、GPT水平明顯升高,說明過量的酒精攝入會(huì)引起肝臟組織損害。與模型對(duì)照組比較,陽性藥物(聯(lián)苯雙酯)組和高、中、低劑量組的GPT、GOT活力顯著低于模型組,表明植物酵素和聯(lián)苯雙酯均可降低肝組織中GPT、GOT酶活力,減少酒精對(duì)肝組織的損傷,從而在一定程度上抑制GOT、GPT活性升高。2.3模型小鼠adh活力乙醇可以使肝臟ADH活性下降。由表5可見:模型對(duì)照組小鼠經(jīng)口灌胃50%乙醇,建立小鼠酒精性肝損傷模型,該模型組小鼠的ADH活力相比較空白對(duì)照組不顯著,表明該酒精性肝損傷模型不成立,可能與給予酒精時(shí)間較短有關(guān),實(shí)驗(yàn)中并未造成嚴(yán)重酒精性肝損傷。與模型組小鼠比較,植物酵素劑量組可明顯升高肝組織ADH活性,升高85.2%(P<0.05),說明植物酵素可通過提高肝組織ADH活性促進(jìn)酒精代謝、降低酒精濃度,起到解酒的作用。2.4酒精性肝損傷模型由表5可見:模型對(duì)照組小鼠經(jīng)口灌胃50%乙醇,建立小鼠酒精性肝損傷模型,該模型組小鼠血清中的甘油三酯(TG)含量顯著高于空白對(duì)照組,表明該酒精性肝損傷模型成立。但是各劑量組及聯(lián)苯雙酯陽性藥物組小鼠血清中的甘油三酯(TG)含量與模型對(duì)照組比較相差較小,T檢驗(yàn)結(jié)果不顯著,可能是一次性灌胃酒精對(duì)于小鼠血清中的脂蛋白影響較小,故結(jié)果差異不明顯。2.5小鼠酒精性肝損傷模型的建立小鼠攝入酒精后會(huì)激活氧分子,產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化。由表5可見:模型對(duì)照組小鼠經(jīng)口灌胃50%乙醇,建立小鼠酒精性肝損傷模型,該模型組小鼠的MDA含量相比較陰性對(duì)照組不顯著,表明該酒精性肝損傷模型不成立?？赡苁且?yàn)橐淮涡怨辔妇凭暮繉?duì)小鼠的肝組織造成脂質(zhì)過氧化損傷不明顯,因此該酒精性肝損傷的模型不成立。2.6造模損傷程度參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)病理切片評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果分析得出:造模損傷程度較輕,不能充分拉開距離;結(jié)果需要與生化相結(jié)合。2.7植物酵素對(duì)小鼠酒精神的影響預(yù)防實(shí)驗(yàn)中小鼠的實(shí)驗(yàn)處理為先給藥后灌酒,結(jié)果如表6所示。實(shí)驗(yàn)組醉酒耐受時(shí)間極顯著高于模型組,陽性藥物Ⅰ組、陽性藥物Ⅱ組相對(duì)于模型組比較,結(jié)果不顯著(P>0.05),但是耐受時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng),說明植物酵素可以有效延遲醉酒;實(shí)驗(yàn)組醒酒時(shí)間與模型組比較明顯減少了44.9%(P<0.01),這說明植物酵素的解酒效果較佳;比較4組的醉酒率和死亡數(shù)也能看出植物酵素對(duì)醉酒小鼠具有明顯的保護(hù)作用;此外,陽性藥物Ⅰ組和Ⅱ組在解酒方面效果不佳,其可能的主要作用是修復(fù)肝損傷。治療實(shí)驗(yàn)中小鼠實(shí)驗(yàn)處理改為先灌酒后給藥,結(jié)果如表7所示。植物酵素組醉酒耐受時(shí)間極顯著高于模型組,陽性藥物Ⅱ組醉酒耐受時(shí)間顯著低于模型組,其耐受時(shí)間較短;植物酵素組醒酒時(shí)間極顯著高于模型組,醒酒時(shí)間顯著縮短30.5%,陽性藥物Ⅰ組、陽性藥物Ⅱ組的醒酒相對(duì)于模型組不明顯,醒酒時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。以上結(jié)果說明植物酵素的解酒效果良好,陽性藥物Ⅰ組和Ⅱ組在解酒方面效果不佳,其可能的主要作用是修復(fù)肝損傷。3不同植物酵素對(duì)肝損傷的保護(hù)作用肝臟的受損傷程度的一個(gè)重要標(biāo)志就是生化指標(biāo)的變化。轉(zhuǎn)氨酶主要分布在肝臟和心肌中,是代謝過程中人體必不可少的酶,正常肝組織內(nèi)GPT含量約為血中的100倍。當(dāng)肝臟實(shí)質(zhì)性損害時(shí),只要有1%的肝細(xì)胞壞死就可使血清活性增加1倍,從而導(dǎo)致GPT、GOT升高,因此轉(zhuǎn)氨酶是肝細(xì)胞損害的敏感標(biāo)志,也是乙醇所致肝損傷最敏感的指標(biāo)。TG是反映肝臟脂肪代謝障礙的敏感指標(biāo),MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,反應(yīng)機(jī)體脂質(zhì)過氧化的嚴(yán)重程度,從而間接反映細(xì)胞的受損傷程度。乙醇脫氫酶(ADH)是人體分解乙醇的主要酶類,主要分布于肝臟。在乙醇被機(jī)體吸收后,在ADH的催化下可被脫氫氧化為乙醛,乙醛具有很強(qiáng)的毒性,是導(dǎo)致肝損傷的直接作用者。ADH分解酒精的速度主要與ADH的量有關(guān),血清中ADH的水平可以反映體內(nèi)酒精代謝的情況,目前大部分解酒藥物也正是基于這一機(jī)制開發(fā)的。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出