基因組研究計(jì)劃

基因組研究計(jì)劃

以南角和稻田為代表的植物因素組的研究取得了迅速進(jìn)展。目前，已在genak數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的近三分之一的dna序列（100mb）序列被確定為genak數(shù)據(jù)庫(kù)。預(yù)計(jì)2001年，全球合作將完成整個(gè)南角樣本鏈的測(cè)定工作。隨著植物基因組計(jì)劃的實(shí)施和進(jìn)展,GenBank中累積了大量的未知功能的DNA序列,如何鑒定出這些基因的功能將成為基因組研究的重點(diǎn)課題,因此,基因組研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容:以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)(functionalgenomics)研究,后者往往又被稱為后基因組(postgenome)研究。功能基因組研究的內(nèi)容是利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息,發(fā)展和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)手段系統(tǒng)地分析基因的功能。目前人類和酵母的功能基因組研究已經(jīng)全面展開,尤其是對(duì)已完成全基因組測(cè)序的酵母來說,其功能基因組研究任務(wù)更加緊迫。植物的基因組研究雖然起步較晚,但由于吸取了人類基因組研究中積累的一些經(jīng)驗(yàn),所以進(jìn)展也相當(dāng)迅速,對(duì)植物功能基因組學(xué)的研究目前也已經(jīng)受到重視,在1998年12月出版的最新一期PlantCell(10:1771)和PlantPhysiol.(118:713)上均編發(fā)了關(guān)于植物功能基因組學(xué)研究的編者按,并由Bouchez和Hofte(1998)綜述了植物尤其是擬南芥功能基因組學(xué)研究的現(xiàn)狀,本文在此基礎(chǔ)上綜述了目前植物功能基因組學(xué)研究中使用的主要技術(shù)手段以及最新的研究進(jìn)展。1實(shí)驗(yàn)證據(jù)的設(shè)置基因的功能主要包括:生物化學(xué)功能,如作為蛋白質(zhì)激酶對(duì)特異的蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化修飾;細(xì)胞學(xué)功能,如參與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞途徑;發(fā)育上的功能,如參與形態(tài)建成等。目前,獲得一段DNA序列的功能信息的最簡(jiǎn)單的方法是將該DNA序列與GenBank中公布的基因序列進(jìn)行同源性比較,如利用BLASTn和BLASTx兩種軟件分別進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性比較等。同源性比較的結(jié)果大體可以分為如下類型:與生化和生理功能均已知的基因具同源性;與生化功能已知的基因具同源性,但該基因的生理功能未知;與其它物種中生化和生理功能均未知的基因具同源性;雖與生化和生理功能均已知的基因具同源性,但對(duì)該基因功能的了解尚不深入,仍停留在表觀現(xiàn)象上。上述同源性檢索分析方法僅僅為該DNA片段的功能提供了間接的證據(jù),對(duì)基因功能的直接證據(jù)還需要實(shí)驗(yàn)上的數(shù)據(jù)。Bouchez和Hofte(1998)將所需要的實(shí)驗(yàn)證據(jù)歸納如下:(1)通過研究基因的時(shí)空表達(dá)模式確定其在細(xì)胞學(xué)或發(fā)育上的功能,如在不同細(xì)胞類型、不同發(fā)育階段、不同環(huán)境條件下以及病原菌侵染過程中mRNA和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)的差異等。(2)研究基因在亞細(xì)胞內(nèi)的定位和蛋白質(zhì)的翻譯后調(diào)控等。(3)利用基因敲除(knock-out)技術(shù)進(jìn)行功能喪失(loss-of-function)分析或通過基因的過量表達(dá)(轉(zhuǎn)基因)進(jìn)行功能獲得(gain-of-function)分析,進(jìn)而研究目的基因與表型性狀間的關(guān)系。(4)通過比較研究自發(fā)或誘發(fā)突變體與其野生型植株在特定環(huán)境條件下基因表達(dá)的差異來獲取基因功能的可能信息。2基因組測(cè)序計(jì)劃通過從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行測(cè)序所獲得的部分cDNA的5′或3′端序列稱為表達(dá)序列標(biāo)記(EST),一般長(zhǎng)300~500bp左右,利用EST作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜被稱為轉(zhuǎn)錄圖譜。目前植物EST計(jì)劃主要集中在擬南芥[3~5]和水稻上,其他植物的EST相對(duì)較少,截止到1998年12月底,在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的各種植物EST的數(shù)目總和已達(dá)幾萬(wàn)條(見表1)。這些EST不僅為植物基因組遺傳圖譜的構(gòu)建提供了大量的分子標(biāo)記,而且來自不同組織和器官的EST也為基因的功能研究提供了有價(jià)值的信息,此外,EST計(jì)劃還為基因的鑒定提供了候選基因(candidates)。EST計(jì)劃的一個(gè)不足之處在于通過隨機(jī)測(cè)序有時(shí)難以獲得那些低豐度表達(dá)的基因和那些在特殊環(huán)境條件下(如生物脅迫和非生物脅迫)誘導(dǎo)表達(dá)的基因,因此為了彌補(bǔ)EST計(jì)劃的不足,必須開展基因組測(cè)序計(jì)劃。通過分析基因組序列能夠獲得基因組結(jié)構(gòu)的完整信息,如基因在染色體上的排列順序,基因間的間隔區(qū)結(jié)構(gòu),啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子的分布等。最近,Bevan等(1998)對(duì)擬南芥第4染色體上的1.9Mb片段進(jìn)行了全序列測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組中平均每4.8Kb就有一個(gè)基因存在,而且54%的基因與GenBank中已知功能的基因有同源性,56%的基因可以與GenBank中的EST相對(duì)應(yīng),大約20%的基因在該染色體片段上以基因家族的形式存在。另外,在該染色體片段中共發(fā)現(xiàn)5種重復(fù)成分:非編碼區(qū)中的重復(fù)DNA序列、反逆轉(zhuǎn)座子成分、葉綠體DNA片段、散布重復(fù)的基因家族成員,以及串聯(lián)重復(fù)的基因家族成員,這些重復(fù)成分約占所測(cè)序列的19%左右。基因組序列測(cè)定所面臨的困難是如何將基因的編碼序列與內(nèi)含子、基因間的間隔序列區(qū)分開來,通常的做法是將所獲得的基因組序列與GenBank中的EST或cDNA序列進(jìn)行對(duì)比以尋找外顯子序列,但是對(duì)那些在GenBank中檢索不到同源基因的基因組序列,就必須依賴特殊的計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分析了,常用的計(jì)算機(jī)分析軟件主要有用于人類基因組研究的GRAIL軟件和植物基因組研究的NetPlantGene軟件,這兩個(gè)分析軟件在互聯(lián)網(wǎng)中均可免費(fèi)使用,其網(wǎng)址如下:GRAIL:/tools/index.shtml;NetPlantGene:http://cbs.dtu.dk//services/NetGene2/。對(duì)植物來說,基因組測(cè)序計(jì)劃還面臨另一個(gè)困難,就是植物前體mRNA的剪接機(jī)制尚未完全闡明,因而即使利用計(jì)算機(jī)軟件也很難從基因組序列中推測(cè)出基因的編碼序列(外顯子)。植物前體mRNA剪接的機(jī)制還因物種而異,如單子葉植物和雙子葉植物前體mRNA的剪接方式就有差別。另外前體mRNA的選擇性剪接(alternativesplicing)方式可能也存在于植物中并對(duì)植物的發(fā)育起重要作用。對(duì)植物前體mRNA剪接機(jī)制的研究目前只在擬南芥中有報(bào)道,并積累了一些資料如擬南芥的內(nèi)含子長(zhǎng)度平均只有200bp左右,平均每個(gè)基因只有少數(shù)幾個(gè)內(nèi)含子等。因此在大力開展基因組測(cè)序的同時(shí),還必須加強(qiáng)對(duì)植物前體mRNA剪接機(jī)制的研究。3轉(zhuǎn)錄組研究的內(nèi)容基因的時(shí)空差異表達(dá)是植物發(fā)育、分化、衰老和抗逆等生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)?；蛟诓煌M織、不同器官以及不同環(huán)境條件下的差異表達(dá)特征,為基因的功能提供了重要的信息。Velculescu等(1997)將在特定組織或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的所有基因及其表達(dá)豐度稱為轉(zhuǎn)錄組(transcriptome),因此在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的基因表達(dá)差異分析實(shí)際上就是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究。經(jīng)典的減法雜交(subtractivehybridization),差示篩選(differentialscreening),cDNA代表差異分析(representativedifferenceanalysis,RDA)以及mRNA差異顯示(differentialdisplay)等技術(shù)已被廣泛用于鑒定和克隆差異表達(dá)的基因,但是這些技術(shù)不能勝任對(duì)大量的植物基因進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析,于是,基因表達(dá)的系統(tǒng)分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)、cDNA微陣列(cDNAmicroarray)和DNA芯片(DNAchip)等能夠大規(guī)模地進(jìn)行基因差異表達(dá)分析的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。3.1sagewelle-nblot檢測(cè)SAGE技術(shù)的主要理論依據(jù)是:來自cDNA3′端特定位置的一段9~11bp長(zhǎng)的序列能夠區(qū)分基因組中95%的基因。這一段基因特異的序列被稱為SAGE標(biāo)簽(SAGEtag)。通過對(duì)cDNA制備SAGE標(biāo)簽并將這些標(biāo)簽串聯(lián)起來,然后對(duì)上述串聯(lián)起來的SAGE標(biāo)簽進(jìn)行測(cè)序不僅可以顯示各SAGE標(biāo)簽所代表的基因在特定組織中是否表達(dá),還可以根據(jù)各SAGE標(biāo)簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達(dá)豐度的指標(biāo)。應(yīng)用SAGE技術(shù)的一個(gè)必要前提是GenBank中必須有足夠的某一物種的DNA序列資料,尤其是EST序列資料。目前該技術(shù)在人類和酵母基因組研究中已得以應(yīng)用,但是尚未用于植物基因組研究。SAGE技術(shù)的不足是不能夠檢測(cè)出稀有轉(zhuǎn)錄物。3.2生物酶法生物利用技術(shù)cDNA微陣列和DNA芯片都是基于reverseNorthern雜交以檢測(cè)基因表達(dá)差異的技術(shù)。二者的基本思路都是首先把cDNA,或EST,或基因特異的寡聚核苷酸固定在固相支持物上,并與來自不同細(xì)胞、組織或整個(gè)器官的mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA探針進(jìn)行雜交,然后用特殊的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)每個(gè)雜交點(diǎn)進(jìn)行定量分析,理論上雜交點(diǎn)的強(qiáng)度基本上反映了其所代表的基因在不同細(xì)胞、組織或器官中的相對(duì)表達(dá)豐度。這兩項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)對(duì)大量基因,甚至整個(gè)基因組的基因的表達(dá)差異進(jìn)行對(duì)比分析。cDNA微陣列技術(shù)是Schena等(1995)發(fā)展起來的,其主要優(yōu)點(diǎn)是:靈敏度極高,mRNA豐度低至10萬(wàn)分之一仍能被檢測(cè)出;使用幾種不同顏色的熒光染料標(biāo)記探針,這樣在同一張陣列膜上進(jìn)行一次雜交實(shí)驗(yàn)就可以同時(shí)分析不同細(xì)胞間或不同環(huán)境脅迫下基因表達(dá)的差異。cDNA微陣列技術(shù)的主要不足是成本非常高,如需要機(jī)器人點(diǎn)膜和特殊的信號(hào)檢測(cè)分析系統(tǒng),點(diǎn)在玻璃片上的array不能重復(fù)使用等。最近,Desprez等(1998)和胡玉欣等(中科院遺傳所,私人交流)分別獨(dú)立發(fā)展了利用尼龍膜作固相支持物和使用同位素標(biāo)記探針進(jìn)行雜交的cDNA表達(dá)陣列技術(shù),從而降低了成本,但檢測(cè)的靈敏度卻降低了(萬(wàn)分之一)。DNA芯片技術(shù)是Affymetrix公司率先研制出來的,該技術(shù)利用結(jié)合化學(xué)手段在玻璃固相支持物上原位合成大量的基因特異的寡聚核苷酸,并與熒光標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交,再利用特殊的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)分析,就可以獲得基因的時(shí)空差異表達(dá)譜,最近Ramsay(1998)對(duì)DNA芯片技術(shù)的原理和應(yīng)用進(jìn)行了較全面的介紹,這里不再贅述。3.3蛋白質(zhì)雙向電泳轉(zhuǎn)錄不是基因表達(dá)的最終結(jié)果,基因功能的實(shí)現(xiàn)最終是以蛋白質(zhì)的形式體現(xiàn)的,因此,在轉(zhuǎn)錄水平上所獲取的基因表達(dá)的信息有時(shí)并不足以揭示該基因在細(xì)胞內(nèi)的確切功能。蛋白組指的是由基因組表達(dá)產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱,由英文單詞protein的前半部加上單詞genome的后半部組合而成。蛋白質(zhì)雙向電泳是目前蛋白組研究的首選技術(shù),但是該技術(shù)在以下方面尚需改進(jìn):分辨率和可重復(fù)性;蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的自動(dòng)定量檢測(cè)系統(tǒng),以及蛋白質(zhì)N端和內(nèi)部氨基酸序列測(cè)定技術(shù)等。利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對(duì)基因敲除(knock-out)突變體或轉(zhuǎn)基因重組體與野生型個(gè)體間雙向電泳蛋白圖譜的差異進(jìn)行對(duì)比分析就可以對(duì)目的基因的功能進(jìn)行分析。在植物上該技術(shù)已被用來分離新的基因,Damerval等(1998)分析了玉米Opaque2基因的近等基因系之間的雙向電泳蛋白圖譜的差異,結(jié)果鑒定克隆了一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄激活因子基因。對(duì)水稻鹽脅迫處理和ABA處理前后的雙向電泳蛋白圖譜進(jìn)行的對(duì)比分析同樣克隆了幾個(gè)與水稻耐鹽性相關(guān)的胚胎晚期豐富蛋白(lea)基因。3.4篩選突變體群體傳統(tǒng)的遺傳學(xué)或稱為正向遺傳學(xué)(forwardgenetics)主要研究自發(fā)或誘發(fā)突變體中某一突變性狀的遺傳行為,如控制突變性狀的基因的數(shù)目及其在染色體上的位置、突變性狀在后代中的傳遞規(guī)律等。反求遺傳學(xué)(reversegenetics)是在已知基因序列的基礎(chǔ)上研究基因的生物學(xué)功能,一般通過創(chuàng)造功能喪失(loss_of_function)突變體并研究突變所造成的表型效應(yīng)。在微生物和小鼠中可以通過同源重組的方法用突變的基因取代野生型基因創(chuàng)造功能喪失突變體進(jìn)行反向遺傳學(xué)研究,但在植物中很難進(jìn)行同源重組試驗(yàn),不過植物中有成熟的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽(transposontagging)系統(tǒng)和T_DNA標(biāo)簽系統(tǒng),而且目前已經(jīng)獲得了擬南芥、金魚草、番茄、玉米和水稻等植物的轉(zhuǎn)座子插入誘變的突變體群體,以及T_DNA插入誘變了的擬南芥突變體群體。從這些突變體群體中篩選出特異基因被突變了的植株,并對(duì)突變株進(jìn)行表型分析將有助于揭示目的基因的生物學(xué)功能。篩選突變體的常用方法是利用PCR技術(shù),這是在果蠅和線蟲(C.elegans)中發(fā)展起來的比較成熟的方法,其基本思路是根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)一個(gè)引物,再根據(jù)插入元件(轉(zhuǎn)座子或T-DNA)的序列設(shè)計(jì)第二個(gè)引物,用上述引物對(duì)突變體群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,由于只有目的基因插入轉(zhuǎn)座子或T_DNA的突變體才有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,這樣根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)就可以很容易地從數(shù)以千計(jì)的突變體群體中篩選出所需要的突變體。該技術(shù)已經(jīng)在矮牽牛、玉米和擬南芥[28~35]等植物中得以成功應(yīng)用。但是對(duì)數(shù)以千計(jì)的材料進(jìn)行PCR反應(yīng)工作量十分巨大,為克服這一困難,Winkler等(1998)設(shè)計(jì)了利用DNA混合池(pooling)進(jìn)行突變體篩選的實(shí)驗(yàn)程序,結(jié)果只需要進(jìn)行36個(gè)PCR反應(yīng)就可以從由6000個(gè)突變體組成的群體中篩選出單個(gè)的突變株,大大減輕了篩選的工作量,同時(shí)這些突變體的D